Resumo: Os terminais dos cromossomos de Leishmania (Leishmania) amazonensis contêm repetições teloméricas mantidas pela enzima telomerase da seqüência 5'-TTAGGG-3', a qual é conservada também em outros tripanosomatídeos e outros eucariotos. Utilizando-se frações protéicas purificadas a partir de extratos S100 e nuclear, foi possível se detectar atividade de telomerase e três complexos proteína-DNA que se associam in vitro com seqüências teloméricas ricas em G do parasita. A atividade de telomerase de L. (L.) amazonensis foi detectada por ensaio TRAP ("Telomeric Repeat Amplification Protocol") e apresenta características comuns às telomerases já descritas em outros tripanosomatídeos.
Os complexos proteína-DNA foram identificados por EMSA ("Electrophoretic Mobility
Shift Assays") e ensaios de "UV cross-linking" e denominados LaGT1-3 (Leishmania
amazonensis G-strand telomeric protein 1-3). Eles não são formados: i) com DNA telomérico na forma de dupla fita e com fita rica em C, ii) em experimentos de competição específica usando oligonucleotídeos de seqüências de DNA telomérico, ou iii) após o tratamento enzimático com proteinase K. LaGT1 foi o complexo mais específico, o qual é formado com todas as seqüências de DNA telomérico (Tel1-6, Tel30 e Tel36) e não se associa à seqüência telomérica de Tetrahymena. As proteínas que formam os três complexos associam-se com uma seqüência de RNA telomérico rica em G e um complexo similar a LaGT1 é formado com DNA telomérico na forma de dupla fita contendo uma projeção 3' simples fita terminal. A estimativa das constantes de dissociação (Kd) do complexo LaGT1 associado a seqüência telomérica na forma de DNA e dos complexos LaGT2 e LaGT3 associados a seqüências teloméricas na forma de DNA ou RNA,
demonstra que estes se encontram na ordem de nM, característica comum a proteínas que ligam DNA na forma de simples fita. Os componentes protéicos dos complexos LaGT2 e LaGT3 foram purificados por cromatografia de afinidade e identificados após renaturação, como bandas de ~35 kDa e ~52 kDa, respectivamente. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 foi purificado em gel como um complexo irradiado com luz UV de ~18-20 kDa. Os componentes protéicos de LaGT2 e LaGT3 e o complexo irradiado LaGT1 foram digeridos em gel com tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se as técnicas: "Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight" (MALDI-TOF) e "Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry" (LC/ESIMS/MS), a análise dos espectros demonstrou que o componente protéico de ~35 kDa de LaGT2 é homólogo da proteína Rbp38 de Leishmania spp. enquanto, o componente protéico de ~52 kDa
de LaGT3 é similar à subunidade 1 da proteína de replicação A (Rpa-1) de Leishmania spp. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 provavelmente uma proteína de L. (L.) amazonensis que ainda não foi identificada. A identificação das proteínas por espectrometria de massa, possibilitou a clonagem dos genes que codificam às mesmas. Neste trabalho apresentamos a caracterização parcial do gene que codifica o componente protéico do complexo LaGT3: subunidade 1 da proteína de replicação A de L. (L.) amazonensis (LaRpa-1). A análise da sua organização genômica demonstrou que o mesmo encontra-se provavelmente em baixo número de cópias ou em cópia única no genoma do parasita e que ele se localiza em uma banda cromossômica de ~0,8 Mb. Foi realizada também a análise conformacional parcial da interação entre a proteína nativa renaturada LaRpa-1 e o DNA telomérico rico em G de L. (L.) amazonensis (oligonucleotídeo Tel6) por espectroscopia de fluorescência mostrando-se um aumento da intensidade da fluorescência quando ocorre essa interação Ver menos

Abstract: The chromosomal ends of Leishmania (Leishmania) amazonensis contain conserved 5'- TTAGGG-3' telomeric repeats, that are maintained by telomerase. Using Telomeric Repeat Amplification Protocol (TR AP) we detected telomerase activity in protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. Protein complexes that associate in vitro with telomeric DNA sequences, LaGT1-3 (Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein), were identified and characterized by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and UV cross-linking using protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. The three complexes did not form i) with double strand DNA (dsDNA) and the C-rich telomeric strand, ii) in competition assays using specific telomeric DNA oligonucleotides, or iii) after pre-treatment with proteinase K. LaGT1 was the most specific, it is formed with all DNA telomeric sequences (Tel1-6, Tel30 and Tel36) and did not bind a Tetrahymena telomeric sequence. All three LaGTs associated with an RNA sequence cognate to the telomeric G-rich strand and a complex similar to LaGT1 is formed with a dsDNA bearing a 3' G-overhang tail. The dissociation constants (Kd) for LaGT1 complexed with telomeric DNA sequence, and for LaGT2-3 complexed with telomeric DNA and RNA sequences were in the nM range. The protein components of LaGT2 and LaGT3 were purified by affinity chromatography and identified, after renaturation, as ~35 kDa and ~52 kDa bands, respectively. The < 15 kDa protein component of LaGT1 was gel-purified as a UV crosslinked complex of ~18-20 kDa. LaGT2 and LaGT3 protein bands and the irradiated LaGT1 complex were digested by trypsin and the resulting peptides were analysed by mass
espectrometry techniques: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight
(MALDI-TOF) and by Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass
Spectrometry (LC/ESI-MS/MS). The fingerprint analysis showed that the ~35 kDa protein
component of LaGT2 was homologous to the Leishmania spp. Rbp38 protein, whereas the ~52 kDa component of LaGT3 was similar to the putative subunit 1 of replication protein A of Leishmania spp. and the < 15 kDa protein component of LaGT1 was probably a novel
Leishmania protein. The gene encoding the protein-forming complexe LaGT3 (LaRpa-1) were cloning and parcially caracterized, the genomic organization analysis of LaRPA-1 gene showed that it is present probably in low copy number or a single copy and was mapped on a chromosome of ~0,8 Mb. The partial conformational analysis of the interaction between nativeLaRpa-1 and the telomeric G-rich DNA (Tel6) was performed using fluorescence spectroscopy, this analysis showed an increase of the fluorescence when the interaction occurs Ver menos