Orientador : Julia Prado Franceschi

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Peçonhas ofídicas são constituídas principalmente de proteínas. Muitas destas proteínas tem características enzimáticas como as fosfolipases, proteases, esterases, L-aminoacido oxidase, entre outras. Inicialmente, comparamos as atividades enzimáticas e biológicas da peçonha de Bothrops...

Resumo: Peçonhas ofídicas são constituídas principalmente de proteínas. Muitas destas proteínas tem características enzimáticas como as fosfolipases, proteases, esterases, L-aminoacido oxidase, entre outras. Inicialmente, comparamos as atividades enzimáticas e biológicas da peçonha de Bothrops Lanceolatus em relação as atividades de sete espécie de bothrops brasileiras (B-alternatus, B. erythromelas, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B moojeni e B. neuwiedi). Determinados assim, que a peçonha Bothroes lanceolatus apresenta altas atividades caseinolitica, fosfolipasica, esterasica, sobre o TAME e hemorragica, Além disso, apesar de não exibir atividade coagulante sobre plasma humano citratado, esta peçonha coagula o fibrinogenio o que sugere a presença de enzima (s) tipo trombina. Verificamos que, entre as peçonhas estudadas, a atividade TAME-esterasica não está diretamente relacionada com a atividade coagulante sobre plasma. O isolamento da fração esterasica da peçonha de B.lanceolatus foi feito utilizando-se cromatografias de exclusão e de troca iônica. Em cada etapa do isolamento, as amostras foram ensaiadas em relação as atividades TAME-esterasica, caseinolitica, fosfolipasica e coagulante sobre plasma e fibrinogênio humanos. Ao Final deste processo, foi obtida uma fração (F-II-1a ) com atividade esterasica 14,5 vezes maior do que a peçonha total. O rendimento protéico foi de 4%, com uma recuperação de 58% da atividade enzimática. Utilizando-se eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, constatamos que a proteínas presente na fração F-II-1a apresenta uma única cadeia polipeptídica, com peso molecular estimado em 38.100. Em testes de imunoeletroforese e imunodifusão, esta fração reagiu com o soro especifico como com o polivalente promovendo a formação de apenas uma linha precipitação. Estes resultados sugerem elevado grau de pureza da proteína presente na fração F-II-1a Utilizando o TAME como substrato, a fração F-II-1a apresentou os valores de 8,5 X 10 ¿4 M e 38,55 umoles/min/mg para km e velocidade máxima, respectivamente. A atividade TAME esterasica foi fortemente influenciada pelo pH do meio de reação, sendo o valor de 8,05 encontrado como o pH ótimo de hidrolise.Esta atividade não foi afetada pela EDTA 10 mM, ao passo que foi totalmente inibida por PMSF 5mM. A fração F-II-1a apresentou baixa atividade coagulante sobre plasma e fibrinogênio humanos, bem como, uma discreta atividade proterminado que a fração F-II-1a apresenta atividade A'alfa¿ e B 'beta¿ fibrinogenolitica. A cadeia A 'alfa¿ foi rapidamente hidrolisada(10min de reação), enquanto que a B¿beta¿ só foi hidrolisada em tempo prolongados de reação . Esta fração não teve efeito sobre a cadeia 'alfa¿, mesmo após 4h de hidrolise