Glicogenio cardiaco em diabetes experimental : efeitos do tratamento com metformina e/ou glibenclamida sobre as funções cardiacas em coração isolado
Eunice Cristina da Silva Costa
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP C823g
[Cardic glycogen in experimental diabetes: effects of the treatment with metformin and/or glibenclamide on cardic function of isolated heart]
Campinas, SP : [s.n.], 2005.
140p. : il.
Orientador: Antonio Ari Gonçalves
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Objetivos: Metformina e glibenclamida são fármacos utilizados para diminuir a glicemia de diabéticos tipo 2. Metformina reduz a absorção gastrintestinal de glicose e a gliconeogênese hepática e aumenta a captação de glicose periférica. Por sua vez, glibenclamida aumenta a liberação de...
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Resumo: Objetivos: Metformina e glibenclamida são fármacos utilizados para diminuir a glicemia de diabéticos tipo 2. Metformina reduz a absorção gastrintestinal de glicose e a gliconeogênese hepática e aumenta a captação de glicose periférica. Por sua vez, glibenclamida aumenta a liberação de insulina após bloquear canais de K+. Apesar destes efeitos, metformina em altas concentrações e glibenclamida podem influenciar o sistema cardiovascular e acelerar a progressão de doenças vasculares, predispondo o coração à falência cardíaca ou infarto. Estas e outras mudanças fisiológicas podem ser associadas a um ECG anormal, mostrando aumento do intervalo QT e de sua dispersão (QTd). Estas mudanças podem ser associadas a um baixo limiar para arritmias ventriculares e provocar morte súbita durante isquemia. Neste estudo avaliamos os efeitos do tratamento com metformina e/ou glibenclamida em ratos diabéticos por aloxana sobre os intervalos do ECG: QT e suas derivadas QTc, QTd, e QTcd. Em outra série experimental avaliamos a pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo (LVP) e as suas derivadas (DP/Dt+ e DP/Dt-), usando a preparação de Langendorff utilizando coração isolado de ratos diabéticos. A isquemia foi provocada pela perfusão (1 h) com noradrenalina (NE). Além disso, o glicogênio foi medido em coração de ratos antes e após perfusão com noradrenalina. As alterações histológicas no ventrículo também foram estudadas. Métodos: Ratos Wistar machos, diabéticos por aloxana, foram tratados com metformina (3,5, 30 e 74 mg.g-1 de peso corporal ¿ p.c) ou glibenclamida (0,10 mg/g-1 p.c) e/ou glibenclamida e metformina (0,10 + 3,5 mg.g-1 p.c), simultaneamente durante 30 dias. O ECG foi registrado no 15o e 30o dia de tratamento. No 30º dia, sob anestesia, o coração foi isolado e perfundido com solução de Krebs-Henseleit em um aparelho de Langendorff. A isquemia foi induzida com noradrenalina 10-6 M (2 ml.min-1.g-1) mantida durante 1 h na solução perfusora. O glicogênio tecidual (mg.100.mg-1) foi extraído de fragmentos de ventrículo de ratos em repouso ou após a perfusão. O glicogênio foi medido pelo método do fenol sulfúrico. Em outros grupos de ratos, preparados de modo idêntico, os corações foram removidos sob anestesia e fixados em formoldeído em tampão PBS. Secções de ventrículo foram preparadas depois de embebidas em parafina e em seguida, os cortes foram fixados em lâminas e corados pelo método hematoxilina eosina (HE). O ensaio do glicogênio ventricular foi feito usando o método ácido de Schiff. Os núcleos foram contados e as suas áreas foram medidas (mm2). Os grânulos de glicogênio foram detectados pela coloração violeta do citoplasma, usando o método de schiff (PAS positivo) e fotografados. Resultados: Após 15 e 30 dias, a glicemia, o intervalo QT e as suas derivadas aumentaram nos ratos diabéticos. Após 30 dias, a glicemia diminuiu em ratos diabéticos que foram tratados com doses baixa ou intermediária de metformina (3,5 e 30 mg.g-1 p.c.), ou com glibenclamida e com a combinação glibenclamida + metformina (3,5 mg.g-1 p.c.). Entretanto, o grupo tratado com a dose mais alta de metformina (74 mg.g-1 p.c) não teve a sua glicemia diminuída. Por outro lado, nos ratos tratados com doses: baixa ou intermediária de metformina os intervalos do ECG: QTc, QTd e QTcd foram reduzidos, em relação ao grupo diabético tratado com a maior dose de metformina. Estes resultados também produziram melhores efeitos em comparação aos grupos diabéticos tratados com glibenclamida e nos grupos tratados com a associação glibenclamida e metformina. Doses baixas, intermediárias e altas (3,5, 30 e 74 mg.g-1 p.c.) de metformina aumentou o armazenamento de glicogênio no ventrículo de ratos diabéticos de 0,19 ± 0,007 (controle) para 0,38 ± 0,007 mg.100 mg-1, 0,5 ± 0,05 mg.100 mg-1 e 0,7 ± 0,04 mg.100 mg-1 (p< 0,05), respectivamente. Quanto à pressão sistólica ventricular, houve rápido aumento da pressão logo no inicio da perfusão com NE no grupo controle, com pico de pressão a 145 ± 9,7 mmHg), seguido de lenta queda até 99 ± 3 mmHg. Esta tendência foi observada também nas derivadas DP/Dt+ e DP/Dt-. Metformina (3,5 e 30 mg.g-1 p.c) e glibenclamida isoladamente ou em associação com metformina protegeram o músculo cardíaco durante a isquemia, não diferindo do grupo controle. Contudo, ratos diabéticos não tratados ou tratados com a maior dose de metformina, desenvolveram pressão sistólica máxima inferior a todos os grupos experimentais, revertendo aos níveis basais mais rapidamente que nos demais grupos. As derivadas DP/Dt+ e DP/Dt- mostraram curvas semelhantes. Após a isquemia, o glicogênio diminuiu em todos os grupos, sendo 0,09 ± 0,007 no grupo controle; 0,1 ± 0,006 nos diabéticos e 0,6 ± 0,005 nos diabéticos tratados com 74 mg.g-1 pc de metformina. O tratamento com glibenclamida e/ou metformina diminuiu o estoque de glicogênio de 0,62 ± 0,05 mg.100 mg-1 para 0,19 ± 0,05 mg.100 mg-1 e de 0,74 ± 0,03 mg.100 mg-1 para 0,22 ± 0,008 mg.100 mg-1, respectivamente. Entretanto, a utilização de glicogênio foi proporcional em todos os grupos. A análise morfológica demonstrou um aumento na quantidade dos núcleos no coração de ratos diabéticos de 21,33 ± 1.17 (no grupo controle) para 36,6 ± 5 (p< 0,05) e redução na média da área dos núcleos, de 0,16 ± 0,02 (controle) para 0,08 ± 0,01 (p< 0,05). No grupo tratado com a menor concentração de metformina (DM 3.5) diminuiu a quantidade de núcleos de 36,6 ± 5 (grupo diabético) para 22,8 ± 2 (p< 0,05), porém aumentou a média da área dos núcleos de 0,08 ± 0,01 mm2 para 0,17± 0,01 mm2 (p< 0,05). Nos grupos tratados com as maiores doses de metformina (30 e 74 mg.g-1 p.c.), a quantidade de núcleos aumentou para 34,16 ± 1,85 e 47,29 ± 2,92, respectivamente), e suas respectivas áreas aumentaram para 0,86 ± 0,05 e 0,5 ± 0,06, diferindo dos grupos controle e dos diabéticos não tratados. Nos grupos diabéticos tratados com glibenclamida e glibenclamida + metformina, as áreas dos núcleos aumentaram de 0,08 ± 0,01 mm2 para 0,71 ± 0,09 mm2 e 0,67 ± 0,01 mm2, respectivamente, (p< 0,001). Conclusões: O aumento na dispersão dos intervalos QT com o tratamento pode significar um risco de arritmia que predispõe ratos à morte súbita. Os resultados da pressão obtidos pelo método de Langendorff indicam que a força de contração diminuiu durante o período de isquemia por NE, sugerindo que o coração estava mais rígido. Estes resultados permitem-nos deduzir que as maiores doses de metformina, 74 mg.g-1 indicados como as máximas para humanos, podem causar sérios prejuízos ao trabalho cardíaco em caso de sobrecarga. Por outro lado, altas doses de metformina, de glibenclamida e a associação entre estas drogas aumentam a quantidade e o tamanho dos núcleos. Conseqüentemente, o ventrículo hipertrofia, em decorrência do aumento da atividade celular, prejudicando de modo importante, a estrutura e a função cardíaca. Portanto, este aumento de glicogênio está associado à severidade e à duração do diabetes. Assim, o coração torna-se altamente susceptível à isquemia
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Abstract: Metformin and glibenclamide are pharmacos used to decrease blood glucose on type 2 diabetics. Metformin decreases gastrointestinal absorption of glucose and gluconeogenesis and increases peripheric glucose uptake. Glibenclamide increases insulin secretion by blocking K+ channels. Besides...
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Abstract: Metformin and glibenclamide are pharmacos used to decrease blood glucose on type 2 diabetics. Metformin decreases gastrointestinal absorption of glucose and gluconeogenesis and increases peripheric glucose uptake. Glibenclamide increases insulin secretion by blocking K+ channels. Besides these effects, metformin and glibenclamide may influence cardiovascular system, which accelerate the progression of vascular disease, predisposing heart to failure or infarct. These abnormalities associated to physiological changes may generate an abnormal ECG, with an increased QT interval and its correspondent dispersion (QTd). These changes could be associated to a lower threshold for malignant ventricular arrhythmias and a sudden death by ischemia. The aim of this study was to evaluate the effects of metformin and/or glibenclamide treatment on QT intervals and its derivatives: QTc, QTd, and QTcd. We also evaluated the pressure developed by left ventricle (LVP) and calculate the correspondents derivatives (DP/Dt+ and DP/Dt-) on heart isolated from diabetic rats, under ischemia caused by norepinephrine (NE). Glycogen was measured after ischemia and compared to control heart, non-submitted to NE. We also analyzed the histological changes in ventricle cells. Methods: Male Wistar diabetic rats were treated by metformin (3.5, 30 and 74 µg.g-1 b.w) or glibenclamide (0.13 µg.g-1 b.w) and its association to metformin (0.13 µg.g-1 b.w + 3.5 µg.g-1 b.w) during 30 days. A 6-lead ECG was recorded initially and after 15 and 30 days treatment. At the end, under anaesthesia, heart were isolated and perfused by Krebs-Henseleit solution in a Langendorff apparatus. Ischemia were induced by adding norepinephrine 10-6 M to the solution (2 ml.min-1.g) during 1 h. Glycogen (mg.100 mg-1 wet tissue) was measured on heart at rest or after perfusion, using the fenol sulfuric method. In another group, after anaesthesia hearts were removed, cleaned and fixed in phormoldheyde in PBS buffer. Thin ventricle sections were made and after paraffin embedding, fine slices were cut and stained with hematoxilin eosin (HE). Ventricle glycogen assay was performed on those slides using the acid Schiff process. The number of nuclei was counted out and nuclei area was measured (mm2). Glycogen granules were recognized the violet colored cytoplasm. Results: After 15 and 30 days, glycemia, QT interval and its derivates increased on diabetic rats. On the other hand, diabetic rats treated during 30 days by low and intermediate doses of metformin (3.5 and 30 µg.g-1 b.w.) or glibenclamide or glibenclamide plus metformin, all decreased glycemia. However, the group treated with the highest dose of metformin (74 µg.g-1 b.w) failed to reduce glycemia. On the other hand, the groups treated by low and intermediate doses reduced the ECG intervals: QTc, and QTd, and QTcd, in contrast to the diabetic group treated with the highest metformin dose and the groups treated by glibenclamide and glibenclamide associated to metformin. Metformin, in low and high doses (3.5, 30 and 74 mg.g-1 b.w.) increased glycogen storage on diabetic rat ventricle, from 0.19 ± 0.007 (control group) to 0.38 ± 0.007 mg.100 mg-1, 0.5 ± 0.05 mg.100 mg-1 and 0.7 ± 0.04 mg.100 mg-1, p< 0.05, respectively. The treatment with glibenclamide alone or associated to metformin increased glycogen, too. In the control group, isolate hearts showed a rapid increase on ventricular pressure, just initiation of NE perfusion (145 ± 9.7 mmHg), followed by a slow fall to 99 ± 3 mmHg. Similar changes was found on the derivates DP/Dt+ and DP/Dt-. Metformin (3.5 and 30 mg.g-1), glibenclamide and glibenclamide associated to metformin protected cardiac muscle during ischemia, similarly to the control group (p> 0.05). But, the non-treated diabetic group and the group treated by 74 mg.g-1 of metformin, produced a maximal pressure which were inferior to the control group and the reversion of the LVP, DP/Dt+ and DP/Dt- was faster than that of the control group. After ischemia, glycogen was reduced on all groups to 0.09 ± 0.007 mg.100 mg-1 on control group; 0.1 ± 0.006 mg.100 mg-1 on diabetic group and 0.06 ± 0.005 mg.100 mg-1 on DM74. However, this decrease was inferior to that of the group treated by the highest dose. The treatment with glibenclamide alone and associated to metformin diminished glycogen storage from 0.62 ± 0.05 mg.100 mg-1 to 0.19 ± 0.05 mg.100 mg-1 and 0.74 ± 0.03 mg.100 mg-1 to 0.22 ± 0.008 mg.100 mg-1. However its utilization was proportional for all groups. Heart submitted to ischemia decreases its reserve, (p< 0.05 compared to non-ischaemic). These results suggested that high doses metformin, in special 74 mg.g-1 b.w., indicated as maximal for humans, makes heart prompt to ischemia. Diabetic rat hearts showed an increase on the amount of nuclei, from 21.33 ± 1.17 to 36.6 ± 5 (p< 0.05) and a reduction of its area, from 0.16 ± 0.02 mm2 to 0.08 ± 0.01 mm2 (p< 0.05) in comparison to the control group. The lowest dose of metformin (DM 3.5) diminished the amount of nuclei (36.6 ± 5 vs 22.8 ± 2; p< 0.05) and increased theirs size (0.08 ± 0.01 vs 0.17± 0.01). The amount of nuclei increased to 34.16 ± 1.85 and 47.29 ± 2.92 during the treatment with high metformin doses, (30 and 74 mg.g-1 b.w., respectively), and the nuclei area increased to 0.86 ± 0.05 mm2 and 0.5 ± 0.06 mm2, respectively, differing from control and non-treated diabetic groups. Similar result, was obtained on the group treated by glibenclamide and/or metformin, on cardiac cells, which the nuclei area increased to 0.71 ± 0.09 mm2 and 0.67 ± 0.01 mm2, respectively, (p< 0.001). Conclusions: The increased dispersion of QT intervals during treatment may be subjacent to the risks of arrhythmias that predispose humans to sudden death. Results shown on Langendorff methodology indicate that contraction force decreased, suggesting that ventricle muscle were prone to ischemia. Then, high metformin doses (74 mg.g-1), as indicated for humans, may cause damage to cardiac work during overload. High metformin doses, glibenclamide and glibenclamide associated to metformin increase the number of nuclei, as well, theirs size. Consequently, the ventricle hypertrophy due to an increased cellular activity may cause important injuries to cardiac structure and function. We can conclude that, the increased glycogen content on ventricle was associated to the severity and the duration of diabetes. Then, heart became more susceptible to the ischemia effects
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Gonçalves, Antonio Ari, 1944-2009
Orientador
Silva, Carlos Alberto da
Avaliador
Moreno Junior, Heitor, 1958-
Avaliador
Areas, Miguel Arcanjo, 1952-
Avaliador
Kassisse, Dora Maria Grassi, 1964-
Avaliador
Alves, Armindo Antonio, 1958-
Avaliador
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