Resumo: O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de técnicas moleculares diferenciais para o diagnóstico do Vírus da Bronquite Infecciosa (VBI), responsável por infecções respiratória e urogenital agudas, altamente contagiosas em frangos e galinhas, e do Pneumovírus Aviário (PVA), agente etiológico da Rinotraqueíte dos Perus e associado à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI) em galinhas. Sorotipos do VBI e subtipos do PV A foram cultivados em ovos embrionados e em células CER (Chicken Embryo Related), respectivamente. Foram adaptadas as técnicas de extração do RNA viral, RT -PCR, nested-PCR subtipo-especmco. para o PVA e RT -PCR-RFLP para o VBI a partir dos vírus cultivados, sendo testadas posteriormente em material coletado de aves infectadas experimentalmente. Tanto o PVA como o VBI foram detectados por RT-PCR e/ou nested-PCR nos grupos infectados com os agentes isoladamente ou em co-infecção, principalmente nos dias 3 e 6 pós-inoculação. As técnicas diagnósticas desenvolvidas foram então utilizadas na detecção viral de materiais clínicos, obtidos de plantéis avícolas com histórico de problemas respiratórios e sorologia positiva para os agentes estudados. Para o PVA obteve-se a detecção de oito vírus de campo, todos pertencentes ao subtipo A, donde foi possível o isolamento de quatro amostras. No caso do VBI foram detectadas três amostras de campo, todos diferenciados da amostra vacinal por RFLP, dos quais isolou-se duas amostras em ovos embrionados. Amostras positivas tiveram seus fragmentos de PCR seqüenciados, confirmando a classificação obtida através da nested-PCR para o PVA e do RFLP para o VBI. A análise das seqüências do VBI mostrou que os isolados de campo diferem de todos os sorotipos descritos até o momento. As técnicas molecu1ares otimizadas nesse estudo confinaram sua capacidade em diferenciar os subtipos A e B do PV A, bem como as variantes detectadas de VBI de campo e o sorotipo vacinal, demonstrando ser adequadas alternativas diagnósticas e valiosas ferramentas para estudos de epidemiologia molecular Ver menos

Abstract: The aim of this study was the development of molecu1ar techniques able to differentiate Infectious Bronchitis Virus (IBV), responsible for high 'contagious acute respiratory and renal infections in chickens, and Avian Pneumovirus (APV), causal agent of Turkey Rhinotracheitis and associated to Swollen head Syndrome (SHS) in chickens. APV and IBV strains, representatives of subtypes A and B and serotype Massachussets, were multiplied in Chicken Embryo Related (CER) cell line and embrionated eggs, respectively. The techniques of RNA extraction, RT -PCR, APV subtype-specific nested-PCR and RT -PCR-RFLP for IBV diagnosis were adapted, and then tested in experimentally infected chickens. Both viruses were detected by RT -PCR and/or nested-PCR in the groups infected with the agents separately or in co-infection, mainly at 3rd end 6th day post infection. Moreover, these techniques were utilised in clinical field samples from chicken and turkey flocks with respiratory problems and positive APV and IBV serology. Eight APV were detected, all of them classified as subtype A, where four samples were isolated. In the case of IBV, three field samples were detected, originating two viral isolation, all different from vaccine serotype by RFLP. The PCR products were sequenced, confirming the APV nested-PCR and IBV RFLP classification. IBV sequence analysis showed that the Brazilian field samples detected in this study are distinct from all serotype described 50 far. These optimised techniques could be useful to direct differentiation of APV subtypes A and B, and IBV field and vaccine strains, proving to be a valuable molecular epidemiological tool Ver menos