Resumo: As plaquetas estão associadas não só às atividades hemostáticas, como também à resposta inflamatória. O comprometimento funcional das plaquetas está relacionado à ocorrência de patologias hemorrágicas e ao maior risco para desenvolvimento de aterosclerose e doença arterial oclusiva. O primeiro objetivo deste estudo foi estudar as alterações do complexo das glicoproteínas de membrana plaquetária (GP) Ib(a e f3)-IX-V que levam à perda da sua capacidade hemostática, resultando na patologia hemorrágica denominada Síndrome de Bernard-Soulier (SBS). Foram avaliadas as alterações moleculares da GP Iba, que contém os sítios de ligação para fator de von Willebrand (FvW), trombina e integrinas (presentes na região N-terminal globular da GP Iba). Entre os casos com plaquetopenia persistente avaliados no Ambulatório de Hemostasia do Hemocentro da Unicamp, houve a confirmação do diagnóstico de SBS em três pacientes. Em dois destes indivíduos com SBS foi possível identificar duas mutações distintas em homozigose na região N-terminal globular da GP Iba. Uma destas mutações é resultado da troca de T~A, levando à substituição da Cys209 ~ Ser, comprometendo uma das ligações dissulfídicas que ocorrem entre os resíduos Cys209 - Cys248 e Cys211 - Cys268. Esta mesma mutação já havia sido descrita anteriormente por Simsek e cols. (1994). A segunda mutação evidenciou pela primeira vez a ocorrência da troca de T~C, com substituição da Leu115~Pro, na região das repetições ricas em leucina da GP Iba. Em ambos os casos a avaliação por citometria de fluxo mostrou que a GP Iba estava ausente, sugerindo que estes resíduos sejam essenciais para manter a integridade da molécula. o terceiro paciente apesar do diagnóstico clínico e laboratorial de 888, confirmado pela ausência das GP Iba e GP IX pela citometria de fluxo evidenciou exclusivamente uma alteração não descrita no códon iniciador ATG do gene da GP IbB, levando à substituição da -25Met --7 Arg em heterozigose. No entanto, foi observado que outros membros da família, apesar de assintomáticos, eram portadores da mesma alteração. Embora na literatura, a 888 seja relacionada exclusivamente com mutações ocorrendo nos genes da GP Iba, GP IbB e GP IX, é possível que a diferença fenotípica e clínica deste caso possa revelar outros mecanismos reguladores do complexo GP Ib-IX-V possam estar envolvidos na ocorrência da 888. Na outra parte deste estudo, foi estudada a prevalência genotípica de três polimorfismos da GP Iba: seqüência Kozak, HPA-2 e VNTR. A avaliação de 492 indivíduos brasileiros, pertencentes a três grupos étnicos distintos (caucasóides; negróides e indígenas), permitiu a identificação de dez haplótipos distintos, onde: o Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC foi o mais comum (-40%) entre os caucasóides e negróides e o Kozak- TT/HP A-2aaNNTR-CC e Kozak- TC/HP A-2aaNNTR-CC estiveram presentes na mesma proporção entre os indígenas. Embora anteriormente fosse descrita a presença de uma ligação de desequilíbrio entre os polimorfismos VNTR e HPA-2, neste estudo esta ligação não foi completa em cerca de 10% dos indivíduos de todos os três grupos. Dois indivíduos não relacionados apresentaram uma variante rara, o alelo VNTR - E, onde há perda da seqüência de 39 pb, o que foi confirmado pelo seqüenciamento da região. O estudo funcional das plaquetas destes indivíduos e seus familiares, não evidenciaram diferença em relação às demais variantes do VNTR. alelo VNTR-A com quatro cópias da repetição de 39 pb, presente em populações asiáticas, não foi encontrado em nenhum dos cerca de 1.000 indivíduos aqui estudados. No entanto, entre duas espécies de primatas não humanos (chimpanzé e gorila), ambos apresentaram oalelo VNTR-A em homozigose (Kozak-TT/HPA- 2aaIVNTR-AA). Foi possível desta maneira sugerir um novo mecanismo evolutivo para o surgimento das variantes do gene da GP Iba, onde diferentemente do proposto anteriormente, acreditamos que a variante com maior número de cópias tenha precedido as demais, e com a perda sucessiva destas cópias, as variantes menores foram surgindo. Finalmente em um estudo caso-controle investigou-se o risco para ocorrência de infarto agudo do miocárdio (IAM) relacionado aos três polimorfismos da GP Iba. Foram avaliados 350 indivíduos com antecedente de IAM, divididos em grupo 1, que foram incluídos no momento do primeiro IAM e grupo 2, que sobreviveram a um ou mais episódio de IAM há mais de seis meses. Estes pacientes foram pareados por sexo, idade e raça a 350 controles. O genótipo VNTR-CD, assim como o alelo D, foi mais freqüente entre os pacientes com IAM que entre os controles. Embora esses resultados sejam diferentes do descrito na literatura. A análise da gravidade da doença coronariana oclusiva, baseada no número de vasos com obstrução de pelo menos 50% do lúmen, mostrou um aumento significativo da prevalência do alelo D entre os indivíduos com doença mais grave. Os resultados deste trabalho corroboram com estudos anteriores sobre a influência dos polimorfismos do gene da GP Iba e a função plaquetária Ver menos

Abstract: Platelets are associated not only with haemostatic activity, but also with inflammatory response. Functional alterations of platelets are related with bleeding diseases and with a greater risk for developing atheriosclerosis and occlusive artery disease. In this study we analyzed the molecular alterations in the platelet membrane glycoprotein (GP) Iba, the subunit of the complex GP Ib(a and ~)-IX-V. The GP Iba contains binding sites for von Willebrand factor (vWF), thrombin and actin-binding proteins. First of ali, we studied the mutations in the complex GP Ib-IX-V related with the 1055of haemostatic function, resulting in a bleeding disease denominated Bernard-Soulier syndrome (BSS). We identified two distinct mutations in homozygous affecting the Nterminal globular region (where the vWF and thrombin biding sites are located) in two unrelated subjects with BSS. One of these mutations, was first describe by Simsek et aI., 1994, where a homozygous single base pair mutation T-7A, resulted in a substitution of a Cys209 -7 Ser, which involving one of the two disulfide loops from the C-terminal flanking sequence between Cys209 - Cys248 and Cys211 - Cys268. The second subject with BSS presented for the first time, the occurrence of a single base pair exchange T-7C, leading to a single amino acid substitution of the Leu115-7Pro, in the region of the leucine-rich repeats of the GP Iba. In both cases a 1055of GP Iba expression was observed, suggesting that these residues, are essential in maintaining the integrity of the molecule. The third case of BSS, presents serious hemorrhagic symptoms and an intense reduce in the platelet number, in addition to a lack of expression of GP Iba and GP IX. Although none of the other family members presented a bleeding history, the mother of the patient, a maternal uncle and her maternal grandfather, presented a mild macrothrombocytopenia. The sequence of the involved genes (GP Iba, GP Ib(3e GP IX), revealed a non described alteration with the exchange of T~G in initial start ATG codon of the GP Ib(3gene exclusively, leading to the substitution of the -25Met ~ Arg in heterozygosity as in the patient and between the affected members of the family. Thus, it may be that the BSS phenotype in this patient involves other proteins or gene regulators related to the complex GP Ib-IX-V. There are no other genes described involving BSS development , except the first three described, GP Iba, GP Ib(3e GP IX. In the other part of this study, we determined the prevalence of the distinct genetic variants of the GP Iba, resulting from three polymorphisms: Kozak sequence, HPA-2 and VNTR. First, 492 subjects from three distinct Brazilian ethnic groups were evaluated, including: Caucasians; African descents, and Indigenous. The presence of 10 distinct haplotypes were determined. The most common (-40%) haplotype was the Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC for both Caucasian and African descents. However, among Indigenous, Kozak-TT/HPA-2aaNNTR-CC and Kozak-TC/HPA-2aaNNTR-CC were equal/y present. Although a strong linkage disequilibrium between VNTR and HPA-2 polymorphism had been observed at first, here we determined incomplete linkage disequilibrium in 10% of the subjects from ali ethnic groups. Two unrelated subjects presented the allele VNTR - E, arare variant lacking the 39bp repeat, and functional platelet studies among these subjects and their family members revealed no abnormalities. No VNTR-A allele, the largest variant containing 4 copies of the repeats, was identified among approximately 1,000 subjects studied in this population. However, homozygosity for the VNTR-A allele (Kozak-TT/HPA-2aaNNTRAA) was determined in two distinct species of non-human primates (chimpanzee and gorilla). These results suggest a greater complex evolutionary mechanism in the macroglycoprotein region of the GP Iba gene, different from that previously proposed, an hypothesis is that the largest variant, VNTR-A should be considered the oldest allele and that subsequent deletions resulted in the smaller forms. We also carried out a case-control study correlating the three polymorphisms of the GP Iba and the risk for myocardial infarction (MI) occurrence. 350 subjects who had suffered a previously episode of MI, were divided into: group 1, having suffered the first MI at the moment of inclusion and group 2, who had survived to one or more episodes of MI, in which the last episode had occurred at least six months before enrollment. These patients were matched by sex, age and race to 350 controls. Genotype VNTRCD, as well as allele D were more frequent among the patients with MI than among controls. Although this differed from that previously described, it was possible to observe that when the severity of coronary artery disease among these patients was analyzed, assigned by the number of affected vessels by coronary angiography, the allele O was also associated with more extensive disease. Also, it is in accordance to functional data related to the polymorphisms of GP Iba gene previously described Ver menos