Avaliação das interações proteicas da quinase de adesão focal (FAK) em miocitos cardiacos : caracterização estrutural e funcional da interação da FAK com a cadeia pesada de miosina sarcomerica
Rosana Yuri Inoue
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP In7a
Campinas, SP : [s.n.], 2005.
81p. : il.
Orientador: Kleber Gomes Franchini
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: O estímulo mecânico é um dos principais fatores responsáveis pelos ajustes funcionais e estruturais do miocárdio em resposta à sobrecarga de trabalho. O estímulo determina a ativação de uma rede complexa de vias de sinalização celulares que culminam com o crescimento hipertrófico de cada...
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Resumo: O estímulo mecânico é um dos principais fatores responsáveis pelos ajustes funcionais e estruturais do miocárdio em resposta à sobrecarga de trabalho. O estímulo determina a ativação de uma rede complexa de vias de sinalização celulares que culminam com o crescimento hipertrófico de cada cardiomiócito. A quinase de adesão focal (FAK) tem sido indicada como principal proteína sinalizadora envolvida na resposta de cardiomiócitosao estímulomecânico.No entanto, os mecanismosde ativação da FAK pelo estímulomecânico aindanão são conhecidos. Na tentativa de entender melhor as vias de sinalização envolvidas no estabelecimento da hipertrofia cardíaca, utilizamos o sistema duplo-morido em levedura para procurar proteínas que se associam a FAK nesta situação. Para isso utilizamos uma construção de FAK contendo a porção C-Terminal e o domínio quinase (FAKNX) para procurar interações protéicas em uma biblioteca de cDNA de miocárdio de rato submetido às 6h de coarctação da aorta. Após o escrutíneo da biblioteca verificamos a existência de uma interação entre a FAK e sítios da região C-Terminal da cadeia pesada de miosina (MHC). A interação FAK/MHC foi confIrmada por ensaios de pulldown com a proteína híbrida GST-Miosina e extratos de miocárdios de rato. Imunotluorescência e microscopia confocal confIrmaram a colocalização da FAK e da MHC na região sarcomérica correspondente à banda A, em cardiomiócitos de ratos neonatos em cultura. Além disso, a demonstração da interação da FAK com MHC foi verifIcada em extratos de MHC purifIcada de corações de ratos neonatos em condições de força iônica elevada, indicando que a ligaçãoFAK-MHCé dependentede uma interação forte. Ensaios depulldown realizados com a porção FERM da FAK mostraram que esta região N-terminal é sufIciente para a interação FAK-MHC. Em experimentos de coimunoprecipitação com extratos de cultura de cardiomiócitos de ratos neonatos, verificamos que o estiramento acompanha-se de diminuição da associação FAKlMHC, efeito este paralelo à fosforilação da FAK no resíduo de tirosina 397. O bloqueio da fosforilação da FAK com PP2 ressaltou a importânciada fosforilação/ativaçãoda FAK na interação FAK/MHC uma vez que, o tratamento bloqueou a dissociação destas proteínas. Experimentos de imunofluorescência e microscopia confocal de miócitos tratados com PP2 confirmaram a colocalização da FAKlMHC mesmo após 60 minutos de estiramento. O ensaio de pulldown do GST-FERM com os extratos de cardiomiócitos estirados também apresentou diminuição na associação FAKlMHC sugerindo que o estiramento produz modificação estrutural e/ou funcionalnos sítios da MHCresponsáveispela interação com a FAK. A interação FAKlMHC apresentacaracterísticascompatíveiscom aquelas esperadas para um sistema transdutor biomecânico, sensível ao estiramento dos miócitos cardíacos Estes resultados são compatíveis com a idéia de que a transdução mecano-bioquímica, ao menos no que se relaciona à FAK é dependentedo estiramentode MHC em cardiomiócitos, podendo neste caso, a FAK ser considerada elemento sensor de estímulo mecânicos em cardiomiócitos
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Abstract: Mechanical stress is a major factor involved in the development of myocardial adaptive and maladaptive changes in heart diseases. Local mechanical forces activate signaling mechanisms in cardiac myocytes inducing the expression of specific genetic programs linked to myocardial structural...
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Abstract: Mechanical stress is a major factor involved in the development of myocardial adaptive and maladaptive changes in heart diseases. Local mechanical forces activate signaling mechanisms in cardiac myocytes inducing the expression of specific genetic programs linked to myocardial structural and functional remodeling. Although mechanical forces might directly trigger signaling mechanisms in cardiac myocytes the mechanism by which they are sensed and convertedinto biochernicalsignals remains elusive. Focal adhesion kinase (FAK) has been implicated as a signaling molecule involved in the early response of cardiac myocytes to mechanical stress. The mechanism of FAK activation by mechanical stimuli is not c1ear.In this study we performed a yeast twohybrid screening in order to search for novel protein binding partners with FAK. We screened a N-Terminal FAK construction containing the FERM and kinase domain (bait) against a cDNA library constructed from a 6h pressure overloaded adult rat left ventricle. We found an interaction between FAK and C-terminal coiled-coil region of a-myosin heavy chain. We confrnned this interaction with pulldown assay with the hybrid protein GST-Myosin and myocardium rat extracts. Laser confocal rnicroscopy confrnned the colocalization of FAK and MHC in the sarcomericregion corresponding to the A band in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs). We also demonstrated FAK and MHC interaction in purified myosin extracts of NRVMs in buffer with high salt concentration indicating that FAK-MHCis a strong interaction. Pulldown assay with GST-FERM showed that the N-Terminal domain is enough for FAK-MHC interaction. In coimmunoprecipitationassays with NRVMs we found out that cyclic stretch reduces FAK-MHC interaction and this effect is parallel to FAK phosphorylationin tyr397. Treatmentwith PP2 inhibitedFAKphosphorylation and blocked FAK-MHC dissociation showing the importance of FAK phosphorylation in FAK-MHC interaction. Laser confocal microscopy of NRMV treated with PP2 confirmed the colocalization of FAK-MHC afier 60 minutes of cyc1ic stretch. GST-FERM pulldown assay with NMRVs extracts presented reduction in FAK-MHC association suggesting that the cyc1ic stretch produces structural and/or functional modification in the C-terminal coiled-coil region of a-MHC responsible for FAK-MHCinteraction. We found out that FAKlMHC interaction presents distinct characteristics compatible with a biomechanical transducer system, responsive to cyc1ic stretch. Our results are compatible with the idea that the mechano-biochemical transduction involving FAK in cardiomyocytes depends on the stretch of MHC. In this case we could consider FAK as a sensor of mechanical stress in cardiomyocytes
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Franchini, Kleber Gomes, 1961-
Orientador
Camargo, Antonio Carlos Martins de
Avaliador
Krieger, Jose Eduardo
Avaliador
Saad, Mario José Abdalla, 1956-
Avaliador
Velloso, Licio Augusto, 1963-
Avaliador
Avaliação das interações proteicas da quinase de adesão focal (FAK) em miocitos cardiacos : caracterização estrutural e funcional da interação da FAK com a cadeia pesada de miosina sarcomerica
Rosana Yuri Inoue
Avaliação das interações proteicas da quinase de adesão focal (FAK) em miocitos cardiacos : caracterização estrutural e funcional da interação da FAK com a cadeia pesada de miosina sarcomerica
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