Os hemocitos larvais de Anticarsia Gemmatalis (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) e sua interação com baculovirus
Eni Braga da Silveira
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP Si39h
Campinas, SP : [s.n.], 2005.
176p. : il.
Orientadores: Sonia Nair Bao, Bergamann Morais Ribeiro
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: A família Baculoviridae é constituída por vírus de fita-dupla de DNA que infectam artrópodes, larvas de lepidópteros em sua maioria. No início da década de 90, descobriu-se que baculovírus possuem genes (p35 e iap) capazes de inibir a apoptose em células hospedeiras, uma estratégia para...
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Resumo: A família Baculoviridae é constituída por vírus de fita-dupla de DNA que infectam artrópodes, larvas de lepidópteros em sua maioria. No início da década de 90, descobriu-se que baculovírus possuem genes (p35 e iap) capazes de inibir a apoptose em células hospedeiras, uma estratégia para garantir a replicação viral. O mutante vApAg, derivado de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) e que possui um
transposon interposto no gene iap3, induz apoptose em uma linhagem celular derivada de Anticarsia gemmatalis, havendo produção de progênie viral. Já o vírus vP35del, derivado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e que possui o gene p35 deletado, também induz apoptose na mesma linhagem celular, porém sem sinais de produção de progênie. Neste trabalho, investigou-se a ocorrência de apoptose in vivo
induzida por vApAg e pelo recombinante p35- derivado de AcMNPV ¿ vHSGFP/P35del em larvas de A. gemmatalis. Utilizou-se como modelo de estudo hemócitos infectados via injeção intrahemocélica de vírus extracelulares. Os hemócitos de A. gemmatalis foram caracterizados e o processo infeccioso de AgMNPV, vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del nestas células foi estudado com base em técnicas morfológicas, tendo sido, ainda,
observadas a mortalidade e alterações no desenvolvimento larval induzidas pelos vírus. Foram observados seis tipos de hemócitos: prohemócitos (pr), plasmatócitos (pl), granulócitos tipo 1 (gh1), granulócitos tipo 2 (gh2), oenocitóides (oe) e esferulócitos (sph), os quais apresentam semelhança geral com o conjunto de hemócitos de outros lepidópteros, inclusive com relação ao seu número total (CTH), às proporções dos diferentes tipos ao
longo do desenvolvimento (CDH) e à atividade de fenoloxidase. A inativação do gene iap-3 de AgMNPV resulta em apoptose para um número considerável de hemócitos em até 72 horas pós-infecção, com a produção de vírus extracelulares e ocluídos. O tempo médio de morte para larvas infectadas com 100 e 1000 PFU de vApAg é cerca de 2,5 dias maior que para as mesmas doses de AgMNPV. A deleção do gene p35 de AcMNPV resulta em uma apoptose de hemócitos discreta, entre 24 e 72 horas pós-infecção, com alguma produção de vírus extracelulares, havendo redução na proporção de hemócitos infectados ao longo do tempo e redução na infectividade das larvas. Para vHSGFP, uma dose da ordem de 105
vezes maior que de AgMNPV foi necessária para causar uma mortalide próxima a 100%. Desta forma, A. gemmatalis consiste em um hospedeiro semi-permissivo a AcMNPV. Ao contrário de AgMNPV e vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del, em geral, não causam liquefação dos insetos. Algumas larvas sobreviventes à infecção por vHSGFP e, principalmente, por vHSGFP/P35del, originam pupas anômalas inviáveis. Todos os tipos de hemócitos de A. gemmatalis são susceptíveis à infecção pelos quatro vírus. Pl e gh1 são mais susceptíveis enquanto gh2 raramente são infectados. Sph são especialmente tolerantes aos vírus derivados de AcMNPV, podendo constituir um dos fatores determinantes da baixa infectividade destes vírus em A. gemmatalis. Gh1 e pl fagocitam células, fragmentos celulares, corpos apoptóticos, vírus extracelulares e ocluídos. Hemócitos infectados
parecem ser alvos de uma resposta citotóxica causadora de necrose. Os resultados deste trabalho reforçam a hipótese de que a apoptose constitui uma estratégia anti-viral importante em insetos, tendo em vista que os mesmos não possuem imunidade adquirida. A compreensão de aspectos da relação patógeno-hospedeiro, especialmente no que diz respeito aos mecanismos de imunidade de insetos contra vírus, pode contribuir para a
otimização dos baculovírus como agentes de controle biológico de pragas e como vetores de expressão de genes heterólogos, bem como colaborar para a descoberta de novos antivirais e para o controle da transmissão de vírus por insetos Ver menos
transposon interposto no gene iap3, induz apoptose em uma linhagem celular derivada de Anticarsia gemmatalis, havendo produção de progênie viral. Já o vírus vP35del, derivado de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) e que possui o gene p35 deletado, também induz apoptose na mesma linhagem celular, porém sem sinais de produção de progênie. Neste trabalho, investigou-se a ocorrência de apoptose in vivo
induzida por vApAg e pelo recombinante p35- derivado de AcMNPV ¿ vHSGFP/P35del em larvas de A. gemmatalis. Utilizou-se como modelo de estudo hemócitos infectados via injeção intrahemocélica de vírus extracelulares. Os hemócitos de A. gemmatalis foram caracterizados e o processo infeccioso de AgMNPV, vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del nestas células foi estudado com base em técnicas morfológicas, tendo sido, ainda,
observadas a mortalidade e alterações no desenvolvimento larval induzidas pelos vírus. Foram observados seis tipos de hemócitos: prohemócitos (pr), plasmatócitos (pl), granulócitos tipo 1 (gh1), granulócitos tipo 2 (gh2), oenocitóides (oe) e esferulócitos (sph), os quais apresentam semelhança geral com o conjunto de hemócitos de outros lepidópteros, inclusive com relação ao seu número total (CTH), às proporções dos diferentes tipos ao
longo do desenvolvimento (CDH) e à atividade de fenoloxidase. A inativação do gene iap-3 de AgMNPV resulta em apoptose para um número considerável de hemócitos em até 72 horas pós-infecção, com a produção de vírus extracelulares e ocluídos. O tempo médio de morte para larvas infectadas com 100 e 1000 PFU de vApAg é cerca de 2,5 dias maior que para as mesmas doses de AgMNPV. A deleção do gene p35 de AcMNPV resulta em uma apoptose de hemócitos discreta, entre 24 e 72 horas pós-infecção, com alguma produção de vírus extracelulares, havendo redução na proporção de hemócitos infectados ao longo do tempo e redução na infectividade das larvas. Para vHSGFP, uma dose da ordem de 105
vezes maior que de AgMNPV foi necessária para causar uma mortalide próxima a 100%. Desta forma, A. gemmatalis consiste em um hospedeiro semi-permissivo a AcMNPV. Ao contrário de AgMNPV e vApAg, vHSGFP e vHSGFP/P35del, em geral, não causam liquefação dos insetos. Algumas larvas sobreviventes à infecção por vHSGFP e, principalmente, por vHSGFP/P35del, originam pupas anômalas inviáveis. Todos os tipos de hemócitos de A. gemmatalis são susceptíveis à infecção pelos quatro vírus. Pl e gh1 são mais susceptíveis enquanto gh2 raramente são infectados. Sph são especialmente tolerantes aos vírus derivados de AcMNPV, podendo constituir um dos fatores determinantes da baixa infectividade destes vírus em A. gemmatalis. Gh1 e pl fagocitam células, fragmentos celulares, corpos apoptóticos, vírus extracelulares e ocluídos. Hemócitos infectados
parecem ser alvos de uma resposta citotóxica causadora de necrose. Os resultados deste trabalho reforçam a hipótese de que a apoptose constitui uma estratégia anti-viral importante em insetos, tendo em vista que os mesmos não possuem imunidade adquirida. A compreensão de aspectos da relação patógeno-hospedeiro, especialmente no que diz respeito aos mecanismos de imunidade de insetos contra vírus, pode contribuir para a
otimização dos baculovírus como agentes de controle biológico de pragas e como vetores de expressão de genes heterólogos, bem como colaborar para a descoberta de novos antivirais e para o controle da transmissão de vírus por insetos Ver menos
Abstract: The Baculoviridae family is composed by double-strand DNA viruses that infect arthropods, generally lepidoptera larvae. In the beginning of the 90's, it was shown that baculoviruses possess genes (p35 e iap) that inhibit apoptosis in host cells - a strategy to guarantee viral replication....
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Abstract: The Baculoviridae family is composed by double-strand DNA viruses that infect arthropods, generally lepidoptera larvae. In the beginning of the 90's, it was shown that baculoviruses possess genes (p35 e iap) that inhibit apoptosis in host cells - a strategy to guarantee viral replication. The mutant vApAg, derived from Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV), which has the iap-3 gene interrupted by a
transposon, induces apoptosis in a cell line derived from Anticarsia gemmatalis, with progeny production. The virus vP35del, derived from Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), which has a deletion in the gene p35, also induces apoptosis in the same cell line, however there is no progeny production. In this work, we have investigated apoptosis in vivo induced by vApAg and by a p35- recombinant derived from AcMNPV - vHSGFP/P35del in A. gemmatalis larvae. Hemocytes were the model chosen for study and the infection occurred by intrahaemocoelic injection of budded viruses. The hemocytes were characterized and the infective processes of AgMNPV, vApAg, vHSGFP and vHSGFP/P35del in these cells were studied based on morphological approaches. It was also observed larval mortality and the effects on larval development caused by these viruses. Six types of hemocytes were observed: prohemocytes (pr), plasmatocytes (pl), granular hemocytes type 1 (gh1), granular hemocytes type 2 (gh2),
oenocytoids (oe) and spherulocytes (sph). They presented great similarity to the hemocytes pool from other lepidoptera, including the total number of these cells in circulation (THC), the proportions of each type during larval development (DHC) and phenoloxidase activity. xix
The inactivation of the iap-3 gene in AgMNPV resulted in apoptosis induction for a great number of hemocytes until 72 hours post infection, with the production of budded and occluded viruses. The mean time to death was delayed in 2.5 days in average for insects inoculated with 100 and 1000 PFU of vApAg, when compared to the same doses of AgMNPV. The deletion of p35 in AcMNPV resulted in a milder apoptosis, between 24 and
72 hours post infection, with some production of budded viruses. It caused a reduction in the proportion of infected hemocytes along the time of infection and reduced larval infectivity. For vHSGFP, a viral dose in the order of 105 times higher than for AgMNPV is needed to cause a mortality ratio around 100%. Therefore, we consider A. gemmatalis as a semi-permissive host to AcMNPV. The recombinants vHSGFP and vHSGFP/P35del
generally do not cause melting of insects, what normally occurs for insects infected by AgMNPV and vApAg. Some surviving larvae infected by vHSGFP and, mainly by vHSGFP/P35del, originate anomalous pupae. All hemocytes types from A. gemmatalis were susceptible to infection by the viruses studied. Pl and gh1 are the most susceptible cells, while gh2 are rarely infected. Sph are especially resistant to AcMNPV-derived viruses. This can constitute one of the factors that determine the low infectivity of AcMNPV in A. gemmatalis larvae. Gh1 and pl phagocytose cells, cell fragments, apoptotic bodies, budded viruses and occluded viruses. Infected hemocytes appear to be targets for a cytotoxic response that causes necrosis. These results reinforce the hypothesis of apoptosis is an important anti-viral strategy in insects, which do not present acquired immunity. A better comprehension of host-pathogen relationships, specially the ones related to insect immunity against viruses, may contribute to an optimization of baculoviruses as biological control agents and heterologous expression vectors, as well as to the iscovery of new antiviral drugs and to the control of virus transmission by insect Ver menos
transposon, induces apoptosis in a cell line derived from Anticarsia gemmatalis, with progeny production. The virus vP35del, derived from Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), which has a deletion in the gene p35, also induces apoptosis in the same cell line, however there is no progeny production. In this work, we have investigated apoptosis in vivo induced by vApAg and by a p35- recombinant derived from AcMNPV - vHSGFP/P35del in A. gemmatalis larvae. Hemocytes were the model chosen for study and the infection occurred by intrahaemocoelic injection of budded viruses. The hemocytes were characterized and the infective processes of AgMNPV, vApAg, vHSGFP and vHSGFP/P35del in these cells were studied based on morphological approaches. It was also observed larval mortality and the effects on larval development caused by these viruses. Six types of hemocytes were observed: prohemocytes (pr), plasmatocytes (pl), granular hemocytes type 1 (gh1), granular hemocytes type 2 (gh2),
oenocytoids (oe) and spherulocytes (sph). They presented great similarity to the hemocytes pool from other lepidoptera, including the total number of these cells in circulation (THC), the proportions of each type during larval development (DHC) and phenoloxidase activity. xix
The inactivation of the iap-3 gene in AgMNPV resulted in apoptosis induction for a great number of hemocytes until 72 hours post infection, with the production of budded and occluded viruses. The mean time to death was delayed in 2.5 days in average for insects inoculated with 100 and 1000 PFU of vApAg, when compared to the same doses of AgMNPV. The deletion of p35 in AcMNPV resulted in a milder apoptosis, between 24 and
72 hours post infection, with some production of budded viruses. It caused a reduction in the proportion of infected hemocytes along the time of infection and reduced larval infectivity. For vHSGFP, a viral dose in the order of 105 times higher than for AgMNPV is needed to cause a mortality ratio around 100%. Therefore, we consider A. gemmatalis as a semi-permissive host to AcMNPV. The recombinants vHSGFP and vHSGFP/P35del
generally do not cause melting of insects, what normally occurs for insects infected by AgMNPV and vApAg. Some surviving larvae infected by vHSGFP and, mainly by vHSGFP/P35del, originate anomalous pupae. All hemocytes types from A. gemmatalis were susceptible to infection by the viruses studied. Pl and gh1 are the most susceptible cells, while gh2 are rarely infected. Sph are especially resistant to AcMNPV-derived viruses. This can constitute one of the factors that determine the low infectivity of AcMNPV in A. gemmatalis larvae. Gh1 and pl phagocytose cells, cell fragments, apoptotic bodies, budded viruses and occluded viruses. Infected hemocytes appear to be targets for a cytotoxic response that causes necrosis. These results reinforce the hypothesis of apoptosis is an important anti-viral strategy in insects, which do not present acquired immunity. A better comprehension of host-pathogen relationships, specially the ones related to insect immunity against viruses, may contribute to an optimization of baculoviruses as biological control agents and heterologous expression vectors, as well as to the iscovery of new antiviral drugs and to the control of virus transmission by insect Ver menos
Báo, Sônia Nair
Orientador
Ribeiro, Bergmann Morais
Coorientador
Castro, Maria Elita Batista de
Avaliador
Gregório, Elisa Aparecida
Avaliador
Wolff, José Luiz Caldas
Avaliador
Cruz-Hofling, Maria Alice da, 1944-
Avaliador
Os hemocitos larvais de Anticarsia Gemmatalis (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) e sua interação com baculovirus
Eni Braga da Silveira
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Eni Braga da Silveira
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