Avaliação temporal de neuronios Fluoro-Jade B positivos na formação hipocampal de camundongos apos indicação do status epilepticus por pilocarpina
Andre Luiz do Nascimento
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP N17a
Campinas, SP : [s.n.], 2004.
73f. : il.
Orientador: Francisco Langone
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Status epilepticus induzido pela pilocarpina (SEP) em roedores promove alterações neuropatológicas que levam à epileptogênese. No Modelo de Indução de Epilepsia pela Pilocarpina em camundongos, os efeitos do SEP têm sido menos estudados em camundongos do que em ratos. Nós analisamos o modelo...
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Resumo: Status epilepticus induzido pela pilocarpina (SEP) em roedores promove alterações neuropatológicas que levam à epileptogênese. No Modelo de Indução de Epilepsia pela Pilocarpina em camundongos, os efeitos do SEP têm sido menos estudados em camundongos do que em ratos. Nós analisamos o modelo temporal de injúria neuronal na formação hipocampal de camundongos depois do início do SEP utilizando Fluoro-Jade B e coloração de Nissl. Sessenta camundongos Swiss machos (30-45 g) foram utilizados. Metilnitrato de escopolamina (1 mg/Kg s.c.) foi administrado 30 minutos antes da pilocarpina. Status epilepticus (SE) foi induzido pelo hidrocloreto de pilocarpina (340 mg/Kg i.p.). Os grupos controles receberam doses equivalentes de NaCl 0,9 % no lugar do metilnitrato de escopolamina e da pilocarpina. A evolução do dano neuronal foi medida 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, uma semana e três semanas após o início do SE. Os animais que exibiram crises convulsivas ininterruptas durante três horas desde o início do SE foram incluídos no grupo 3 horas. Nos outros grupos, somente foram incluídos camundongos que tiveram SE ininterrupto por no mínimo 6 horas. Fluoro-Jade B foi utilizado como um marcador específico para degeneração neuronal. Seções adjacentes foram coradas com violeta de cresila para determinar a distribuição das seções no eixo rostro-caudal e para a avaliação da perda neuronal das mesmas regiões avaliadas pelo uso de Fluoro-Jade B. A contagem de neurônios Fluoro-Jade B positivos (FJB+) foi realizada nas camadas piramidais CA1 e CA3 hipocampais e no hilo e camada granular do giro denteado. Os mais altos valores de neurônios FJB+ nas regiões CA1 e CA3 foram encontrados no grupo 1 semana após o início do SE quando comparado com todos os outros grupos, mostrando diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo 3 h após o início do SE e grupos 3 h e 6 horas após o início do SE, respectivamente. No hilo do giro denteado, o número de neurônios FJB+ encontrado foi significativamente maior no grupo 12 h após o início do SE quando comparado aos grupos 3 h e 3 semanas após o início do SE. Na camada granular do giro denteado, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos com SE induzido. Os animais controle não apresentaram marcação para Fluoro-Jade B nos neurônios das mesmas regiões avaliadas. A perda neuronal avaliada pelo violeta de cresila foi realizada, utilizando uma escala em escores de 0 a 4 com intervalos decrescentes de 25 %, comparando-se o número de neurônios saudáveis nos grupos experimentais em relação aos seus respectivos controles. Os mais altos escores alcançados nas regiões CA1 e CA3 foram nos grupos 1 semana após o início do SE, mostrando escores 1 e 4, respectivamente. No hilo do giro denteado, todos os grupos experimentais apresentaram escore 4. Na camada granular do giro denteado, todos os grupos experimentais apresentaram escore 1, com exceção dos grupos 3 h e 12 horas após o início do SE, com escores 0 e 0,5 respectivamente. No presente modelo, a progressão temporal da morte neuronal, evidenciada pela contagem de neurônios Fluoro-Jade B positivos, é similar à observada em ratos. Além disso, nossos dados confirmam o fato de que os neurônios do hilo são mais suscetíveis à injúria excitotóxica produzida pelo SEP. Nossos resultados também reforçam a hipótese de que a propagação da crise convulsiva no SEP requer a ativação do sistema glutamatérgico. Em conclusão, este trabalho provê evidências de que o Modelo de Indução de Epilepsia pela Pilocarpina em camundongos é um modelo confiável e reproduzível para o estudo de eventos fisiopatológicos relacionados à epilepsia do lobo temporal
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Abstract: Pilocarpine-induced status epilepticus (PSE) in rodents promotes neuropathological alterations that lead to epileptogenesis. In the Pilocarpine Model of Epilepsy, the effects of PSE have been less studied in mice than in rats. We analyzed the temporal pattern of neuronal injury in the...
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Abstract: Pilocarpine-induced status epilepticus (PSE) in rodents promotes neuropathological alterations that lead to epileptogenesis. In the Pilocarpine Model of Epilepsy, the effects of PSE have been less studied in mice than in rats. We analyzed the temporal pattern of neuronal injury in the hippocampal formation of mice after the onset of PSE using Fluoro-Jade B and Nissl stain. Sixty adult male Swiss mice (30-45 g) were used. Scopolamine methylnitrate (1 mg/Kg s.c.) was administered 30 min prior to pilocarpine. Status epilepticus (SE) was induced by pilocarpine hydrochloride (340 mg/Kg i.p.). Controls groups received equivalents doses of NaCl 0.9 % instead of scopolamine methylnitrate and pilocarpine. The evolution of neuronal damage was quantified at 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, one week and three weeks after the onset of the SE. Animals that exhibited uninterrupted seizures during 3 h from the onset of SE were included in the first time point group. In the other groups, only mice that had uninterrupted SE for at least 6 hours were included. Fluoro-Jade B was used as a specific marker for neuronal degeneration. Adjacent sections were stained with cresyl violet for determine the distribution of the sections within the rostro-caudal axis and for assessment of the neuronal loss of the same regions evaluated by using of Fluoro-Jade B. Fluoro-Jade B positive (FJB+) neurons count was performed in the CA1 and CA3 pyramidal cell layers and in the dentate gyrus (hilus and granular cell layer). The highest numbers of FJB+ neurons in CA1 and CA3 regions were found at 1 week after SE onset when compared with all the other times, showing differences statistically significant with regard to the group 3 h after onset of SE and to groups 3 h and 6 h after SE onset, respectively. In the hilus of the dentate gyrus, FJB+ neurons were found significantly higher 12 h after SE onset when compared to the 3 h and 3 weeks groups. In the granular cell layer of the dentate gyrus, there was no difference statistically significant between all SE groups. Control animals did not show Fluoro-Jade B staining in neurons of the same regions studied. The neuronal loss assessed by cresyl violet was scored on a 0-4 scale, by estimating in 25 % increments the number of healthy neurons remaining relative to control. The highest scores reached at the in CA1 and CA3 regions were at the groups 1 week, showing scores 1 and 4, respectively. In the hilus of the dentate gyrus, all the time points presented score 4. In the granular cell layer of the dentate gyrus all the groups show score 1, with the exception of the groups 3 h and 12 h after SE onset, with scores 0 and 0.5, respectively. In the present model, the time course of neuronal death evidenced by Fluoro-Jade B based count is similar to that observed in rats. Moreover, our data confirm the fact that neurons of the hilus are more susceptible to the excitotoxic injury produced by the PSE. Our results also reinforce the hypothesis that the spread of seizure in the PSE require activation of glutamatergic system. In conclusion, this work provides evidences that the Pilocarpine Model of Epilepsy in Mice is a reliable and reproducible model to study the physiopathological events underlying temporal lobe epilepsy
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