Expressão do receptor sensor de calcio com mutações e deleção no dominio extracelular
Talita Casagrande Esteves
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP Es85e
Campinas, SP : [s.n.], 2004.
72 p. : il.
Orientador: Lilia Freire Rodrigues de Souza Li
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: o receptor sensor de cálcio (CASR) é membro da família III dos receptores que acoplam à proteína G e é de fundamental importância no processo da homeostase do cálcio. O domínio extracelular (ECD) do receptor é o principal sítio de ligação do Ca/+ e a maioria das mutações naturais que ocorrem...
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Resumo: o receptor sensor de cálcio (CASR) é membro da família III dos receptores que acoplam à proteína G e é de fundamental importância no processo da homeostase do cálcio. O domínio extracelular (ECD) do receptor é o principal sítio de ligação do Ca/+ e a maioria das mutações naturais que ocorrem nesse domínio afeta somente a afinidade do receptor pelo Cao2+.~AJgumasmutações no ECD podem causar uma alteração mais grosseira na estrutura do receptor, com conseqüente redução da sua expressão na superficie celular. O objetivo desta tese foi investigar o grau de expressão do CASR com mutações no ECD, incluindo alterações na polaridade ou no caráter ácido/base, em locais onde mutações ativadoras (ADH) ou inativadoras (FHH/NSHPT) já foram descritas. Além disso, também deletamos a região entre os aminoácidos 139 e 167 do ECD por ser uma região altamente hidrofóbica e cuja importância ainda não foi investigada. A técnica de Westem blotting nos permitiu verificar a expressão de todos os receptores mutados transfectados em células HEK-293. Através da densitometria das bandas de 140 e 160 kDa e a análise estatística do valores obtidos de três experimentos separados, verificamos uma expressão similar ao CASR nativo dos receptores mutados nas posições A116T, N118S, E127K, F128Y, T138K e Ll139-167. O receptor com a mutação P55S apresentou uma drástica redução na expressão das formas diméricas e oligoméricas (-220 kDa) em relação ao CASR nativo. Assim, podemos concluir que a expressão do CASR pode ser afetada de acordo com alterações das características dos aminoácidos nativos (polaridade, caráter ácido/base) e a mudança no padrão de expressão é dependente da posição do aminoácido mutado. A posição 55 demonstrou ser crítica para a expressão das formas diméricas do receptor, enquanto que a região hidrofóbica entre os aminoácidos 139 e 167 não é importante para a expressão nem para a formação de dímeros
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Abstract: The calcium sensing receptor (CASR) is a member of the family III of G protein coupled receptors and plays an essential role in calcium homeostasis. The extracellular domain (ECD) of the receptor is the most important site for Ca/+-binding and the majority of the naturally occurring...
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Abstract: The calcium sensing receptor (CASR) is a member of the family III of G protein coupled receptors and plays an essential role in calcium homeostasis. The extracellular domain (ECD) of the receptor is the most important site for Ca/+-binding and the majority of the naturally occurring mutations in the ECD affects only the affinity of the receptor for Cao2+. Other mutations in the ECD could result in a more gross alteration of the receptor structure, reflected by reducing expression levels of the receptor at the cell surface. The objective of this thesis was to investigate the expression levels of the CASR with mutations in the extracellular domain where activating and inactivating mutations have been described. The mutation resulted in changes in aminoacid polarity or acid/base character. In addition, a deletion of a region between 139 and 167 aminoacids of the extracelullar domain of the CASR, a highly hydrophobic region, was perform to investigate its relevance. The Western blotting technique demonstrated that alI mutant receptors were expressed in HEK-293 cells. Analysis of the intensity of the bands by densitometry in three separate experiments showed no significant differences in expression levels of the mutants Al16T, Nl18S, E127K, F128Y, T138K and ~139-167 compared to the CASR wild type. The mutant receptor P55S showed a drastically decreased expression leveI in the dimeric and oligomeric forms (-220 kDa) when compared to the CASR wild type. In conclusion, the expression of the CASR could be affected by alterations of the amino acids characteristics (polarity, acid/base character) and the changes in the expression levels is dependent on the position of mutated amino acid. The position 55 is critica! for expression of the dimeric forms of the receptor, while the hydrophobic region between 139 and 167 amino acids is not important for the expression nor the dimerization of the CASR
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Expressão do receptor sensor de calcio com mutações e deleção no dominio extracelular
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