Resumo: Introdução: O receptor sensor de cálcio (CASR)pertence à famíliados receptores que acoplam à proteínaG e possui homologiacom a subfamíliados receptores metabotrópicos do glutamato.Ele é importante no processo de homeostase do cálcio,e quando a concentração de cálcio se eleva,ele inibe a secreção de paratonnônio pelas paratireóidese a reabsorção renal de cálcio. O receptor sensor de cálcio possui 1078 aminoácidos, com 612 aminoácidos no domínio extracelular (Em), 250 aminoácidos em sete regiões ttansmembrana (TM) conectadas com 3 alças extracelularese intracelularese uma longa cauda intracitoplasmática com 216 aminoácidos.A região ttansmembrana tem um papel fundamental na ativação do receptor e análise da distn"buiçãodas mutações ativadoras demonstra que a sua porção distal (IM 5, 6, 7 e alça extracelular 3) é a mais crítica no processo de ativação do receptor. O estudo de receptores mutados auxilia a elucidar a imponância da polaridade de detenninados aminoácidos presentes na região ttansmembrana na expressão do CASR A produção da proteína recombinante do domínio extracelulardo CASRproporciona novas expectativaspara uma análiseestruturaldesta regiãotão importante para a ligaçãocom o agonista. Objetivos: Os objetivos do presente estudo foram: 1-investigaro grau de expressão de receptores mutados na região ttansmembrana. 2- Produzir a proteína recombinante do domínio extracelular do CASR em sistema de E.. Resultados e Conclusões: Nos resultados de análise da expressão, observamos que todos os receptores mutados e ttansfectados em células HEK 293 foram expressos, no entanto os receptores mutados nas posiçõesF806C,A824S,A835D e A843Tapresentaram diminuição na expressão quando comparados com o receptor nativo, sugerindo que a mutação de arninoácidoshidrofóbicos para hidrofílicosna porção transmembrana pode diminuir o grau de expressão do CASR Obtivemos alta produção da proteína recombinante correspondente ao domínio extracelular do CASR, entretanto não conseguimos quantidades suficientes de proteína solúveLdevido a fonnação de cOIposde inclusões.Isto sugere que o sistemade E. não é eficiente para produzir proteínas com estruturas mais complexas como o domínio extracelulardo receptor sensor de cálcio Ver menos

Abstract: Introduction: The calcium sensrng receptor is a member of the G protein coupled receptor superlamily.It has homologyto the family3 of the metabotropic glutamatereceptor fami1y. It is impottant to the calcium homeostasis. When the extrncellular calcium concentration increase, the CASR inhibits P1H secretion in the parathyroid cel1sand the calcium reabsorption in the kidney.The structure of the CASRconsistSof 1078amino acids, and it is characterized bya large extracellulardomain (Em) with 612 amino acids residues, seven transmernbrane domains (fMDs) with 250 amino acids and a large intracellulartail of 216 amino acids. The 1M domain has fundamental imponance inthe receptor activation and analysisof the distribution of the activatIDgmutations showsthat its dista!portion (IM 5,6,7 and extrncellularthird loop) is the most critical region for receptor activation. Mutagenesis studies of the calcium sensing receptor willhelp the elucidationof the relevance of the amino acids polarityin the transmernbrane domain and the degree of its expression. The production of a recornbinant pIOtein of the extracellulardomain of the caleium sensing receptor will pIOvidenewperspectivesto the stru.ctUral analysisof this portion of the receptor. Objectives: The objectives of this thesis are: 1- To investigatethe expressionof the receptoIS with of mutations in the transmembrane domain. 2- To produce a recombinant protein of the extracellular domain of the receptOr in an E. coli system. Results and Conclusions: We demonstrated that ali mutant receptOISwere expressed in HEK 293 cel1s,however the mutant receptOISF806C, A824S,A835D and A843T showed reduced expression leveIscompared to the wild type. These resultSshowed that substitution of an hydrophobic tO an hydrophiJicamino acids in the transmembrane domain of the caleium sensingreceptor can impairthe receptor expression.Wewere able to produce the recombinant protein of the extracelullardomain of the CASR,however, very few amount were soluble due to the fonnation of inc1usionbodies. This suggeststhat the E.ali system is not suitable for the production of large scale protein of complex protein such as the extracellularportion of the CASR Ver menos