Desenvolvimento e regulação do sistema NADPH oxidase na linhagem eosinofilia humana
Juan Alvaro Lopez Quintero
TESE
Português
T/UNICAMP L881d
Campinas, SP : [s.n.], 2004.
133p. : il.
Orientador: Antonio Condino-Neto
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: objetivo geral deste projeto foi investigar o desenvolvimento a reguJação do sistema NADPH oxidase na linhagem eosinofilica humana Nos concentramos nos genes CYBB que codifica a gp91-phox, componente principal do heterodímero citocromo b e no gene NCF-I que codifica a p47-phox. A expressão...
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Resumo: objetivo geral deste projeto foi investigar o desenvolvimento a reguJação do sistema NADPH oxidase na linhagem eosinofilica humana Nos concentramos nos genes CYBB que codifica a gp91-phox, componente principal do heterodímero citocromo b e no gene NCF-I que codifica a p47-phox. A expressão destes, e de outros genes estreitamente relacionados, é reguJada segundo a 1àsede diferenciação celular, sendo específica de células mielóides. Nosso estudo baseou-se em dois modelos experimentais. O primen-o desenvolvido a partir de leucócitos derivados de sangue de cordão umbilical, cuhivados com citocinas que promovem o crescimento e a diferenciação de eosinófilos, especificamente interleucina-3 (IL-3) e interleucina-5 (IL-5) e o segundo, desenvolvido a partir do clone 15 de células da linhagem HL-60, cultivado previamente em condições alcaJina.c;e posteriormente estimulado com ácido butírico. Em paralelo, lItili7amos os mesmos sistemas de diferenciação de eosinófilos, com citocinas que influenciam a função fagocítica, especificamente interferon-gama (IFN-y) e :fàtorde necrose tumoral-alfa (TNF-a). Também estud~mos o efeito dos glicocorticóides, em particuJar a dexametasona sobre a atividade
oxidase de células HL-60 clone 15 diferenciadas com citocinas. Examinamos a atividade do sistema NADPH oxidase (por meio da redução do citocromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase) e a expressão dos genes que codificam os componentes do sistema NADPH oxidase gp91-phox e p47-phox. Nossos resultados mostraram que as células HL-60 clone 15 se diferenciam numa linhagem
eosinofilica quando tratadas com ácido butirico 0,5 mM, expressando um fenótipo eosinófilico maduro, com capacidade para liberar superóxido em quantidades relevantes. Também demonstramos que a cuJtura dessas células com IFN-y e TNF-a é suficiente para induzir sua diferenciação eosinofilica, além de expressar transcritos para os componentes gp91-phox e p47-phox do sistema NADPH oxidase. Verificamos que o ácido butírico, IFN-y e TNF-a. juntos tem a capacidade de aumentar a indução do sistema NADPH oxidase, sugerindo que podem utilizar vias comuns ou distintas para estimuJar o sistema NAPDH oxidase, o qual está relacionado ao estágio de desenvolvimento da diferenciação eosinofilica. Por outro lado, observamos que a dexametasona inibe tanto a atividade NADPHoxidasecomo a expressão do enegp91-phoxquandoadministradaantes,masnão apósa diferenciaçãodas céluJaslllr6O clone 15 com IFN-y e TNF-a. Em relação aos leucócitos derivados do sangue de cordão umbilical cuhivados com IL-3 e IL-5,
demonstramos que se diferenciam e demonstram características morfológicas similares a eosinófilos maduros, além de apresentar um incremento significativo na liberação de superóxido e expressão gêniea de gp91-phox no dia 28 de cultura. Os estudos pretendem contribuir para o avanço do conhecimento sobre os mecanismos que reguJam o sistema NADPH oxidase fagocítico humano, em específico na linhagem
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oxidase de células HL-60 clone 15 diferenciadas com citocinas. Examinamos a atividade do sistema NADPH oxidase (por meio da redução do citocromo c especificamente inibida pela superóxido dismutase) e a expressão dos genes que codificam os componentes do sistema NADPH oxidase gp91-phox e p47-phox. Nossos resultados mostraram que as células HL-60 clone 15 se diferenciam numa linhagem
eosinofilica quando tratadas com ácido butirico 0,5 mM, expressando um fenótipo eosinófilico maduro, com capacidade para liberar superóxido em quantidades relevantes. Também demonstramos que a cuJtura dessas células com IFN-y e TNF-a é suficiente para induzir sua diferenciação eosinofilica, além de expressar transcritos para os componentes gp91-phox e p47-phox do sistema NADPH oxidase. Verificamos que o ácido butírico, IFN-y e TNF-a. juntos tem a capacidade de aumentar a indução do sistema NADPH oxidase, sugerindo que podem utilizar vias comuns ou distintas para estimuJar o sistema NAPDH oxidase, o qual está relacionado ao estágio de desenvolvimento da diferenciação eosinofilica. Por outro lado, observamos que a dexametasona inibe tanto a atividade NADPHoxidasecomo a expressão do enegp91-phoxquandoadministradaantes,masnão apósa diferenciaçãodas céluJaslllr6O clone 15 com IFN-y e TNF-a. Em relação aos leucócitos derivados do sangue de cordão umbilical cuhivados com IL-3 e IL-5,
demonstramos que se diferenciam e demonstram características morfológicas similares a eosinófilos maduros, além de apresentar um incremento significativo na liberação de superóxido e expressão gêniea de gp91-phox no dia 28 de cultura. Os estudos pretendem contribuir para o avanço do conhecimento sobre os mecanismos que reguJam o sistema NADPH oxidase fagocítico humano, em específico na linhagem
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Abstract: The aim of t1ús study was to investigate the development and regulation of the NADPH oxidase system in the human eosmophilic lineage. We concentrated our studies in the CYBB gene, which encodes the gp91-phox, the main component of the heterodimer cytocbrome b and NCF-I gene, which encodes...
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Abstract: The aim of t1ús study was to investigate the development and regulation of the NADPH oxidase system in the human eosmophilic lineage. We concentrated our studies in the CYBB gene, which encodes the gp91-phox, the main component of the heterodimer cytocbrome b and NCF-I gene, which encodes the p47-phox protein. The expression of these genes js regulated according to the phase of celluJar differentiation, SPeCificof myeloid cells. Our study was basedon two experimentalmodels. The first one, was developed with leukocytes ftom umbilical cord blood, cultured with cytokines tbat promote the
eosinophilic growing and differentiation, specifically interleukin-3 (ll.-3) and interleukin-5 (IL-5) and the second one, was established with HL-60 clone 15 ceUs,previously cultured in aIkaline conditions and later stimuJated with butyric acid. In parallel, we used the same systems of eosinophil differentiation, with cytokines tbat influence the phagocytic function, specifically interferon-gamma (IFN-y) and tumor necrosis Jàctor alpba (TNF- a). The effects of the glucocorticoids, particuIary dexamethasone on the oxidase activity of HL-6O clone 15 cells differentiated with cytokines were also studied. We examined the
NADPH oxidase system activity (by means of the reduction of cytochrome c specüically inhibited by superoxide dismutase) and the gene expression of gp91-phox and p47-phox, components ofNADPH oxidase system. Our results showed tbat, the HL-60 clone 15 cells were differennated in 3Deosinophilic lineage when were treated with butyric acid 0,5 mM, expressing a mature eosinophils phenotype, able to release superoxide in excellent amounts. We aIso demonstrated, tbat the cuhure of these cells with IFN-y e TNF-a are su:fficient to induce the eosmophilic differentiation, besides expressing 1ranscripts of
gp91-phox and p47-phox. We observed tbat butyric acid, IFN-y e TNF-a together are able to increase the NADPH oxidase system induction, which suggests tbat they can use common or distinct pathways to stimuJate the NAPDH oxidase system, which :isrelated with the phase of eosinophilic djfferentiation development. On the other hand, we observed tbat dexamethasone mbibits the NADPH activity oxidase,
aswellasgp91-phoxgene expressionwhenadministeredbefure,but not afterHL-6Oclone 15 cells differentiation with IFN-y e TNF-a. Regarding the umbilical cord blood leucocytes cultured with IL-3 and IL-S, similar morphologic characteristics to that of matme eosinoplilis were obsetved, besides presenting a significant Ü1creasein superoxide release and expression of gp9l-phox gene in day 28 of culture. The studies intend to oontribute to the advance of the knowledge on the mecbanisms that reguJate the human phagocytic NADPH oxidase system, specifically in the human eosinophilic Jineage Ver menos
eosinophilic growing and differentiation, specifically interleukin-3 (ll.-3) and interleukin-5 (IL-5) and the second one, was established with HL-60 clone 15 ceUs,previously cultured in aIkaline conditions and later stimuJated with butyric acid. In parallel, we used the same systems of eosinophil differentiation, with cytokines tbat influence the phagocytic function, specifically interferon-gamma (IFN-y) and tumor necrosis Jàctor alpba (TNF- a). The effects of the glucocorticoids, particuIary dexamethasone on the oxidase activity of HL-6O clone 15 cells differentiated with cytokines were also studied. We examined the
NADPH oxidase system activity (by means of the reduction of cytochrome c specüically inhibited by superoxide dismutase) and the gene expression of gp91-phox and p47-phox, components ofNADPH oxidase system. Our results showed tbat, the HL-60 clone 15 cells were differennated in 3Deosinophilic lineage when were treated with butyric acid 0,5 mM, expressing a mature eosinophils phenotype, able to release superoxide in excellent amounts. We aIso demonstrated, tbat the cuhure of these cells with IFN-y e TNF-a are su:fficient to induce the eosmophilic differentiation, besides expressing 1ranscripts of
gp91-phox and p47-phox. We observed tbat butyric acid, IFN-y e TNF-a together are able to increase the NADPH oxidase system induction, which suggests tbat they can use common or distinct pathways to stimuJate the NAPDH oxidase system, which :isrelated with the phase of eosinophilic djfferentiation development. On the other hand, we observed tbat dexamethasone mbibits the NADPH activity oxidase,
aswellasgp91-phoxgene expressionwhenadministeredbefure,but not afterHL-6Oclone 15 cells differentiation with IFN-y e TNF-a. Regarding the umbilical cord blood leucocytes cultured with IL-3 and IL-S, similar morphologic characteristics to that of matme eosinoplilis were obsetved, besides presenting a significant Ü1creasein superoxide release and expression of gp9l-phox gene in day 28 of culture. The studies intend to oontribute to the advance of the knowledge on the mecbanisms that reguJate the human phagocytic NADPH oxidase system, specifically in the human eosinophilic Jineage Ver menos
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