Permeabilidade mitocondrial transitoria na excitotoxicidade e na lesão neuronal da acidemia metilmalonica
Evelise Neves Maciel
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP M187p
Campinas, SP : [s.n.], 2004.
138p. : il.
Orientadores: Roger Frigerio Castilho, Anibal Eugenio Vercesi
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Resumo: A permeabilidade mitocondrial transitória (PMT) tem sido implicada na morte celular em diversos modelos de desordens neurodegenerativas, incluindo hipoglicemia, isquemia e trauma cerebral. No presente trabalho, estudamos a PMT em mitocôndrias isoladas de cérebro de rato. A PMT induzida por...
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Resumo: A permeabilidade mitocondrial transitória (PMT) tem sido implicada na morte celular em diversos modelos de desordens neurodegenerativas, incluindo hipoglicemia, isquemia e trauma cerebral. No presente trabalho, estudamos a PMT em mitocôndrias isoladas de cérebro de rato. A PMT induzida por Ca2+ foi estimulada por Na+ e prevenida pela combinação de ADP e ciclosporina A (CsA), inibidores da PMT. EGTA, um quelante de Ca2+,ou a inibição da captação de Ca2+por vermelho de rutênio, revertem parcialmente a dissipação do potencial de membrana mitocondrial associada à PMT. Esta foi significantemente inibida por catalase, indicando a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) neste processo. Pela detecção de EROs por meio da oxidação do marcador diclorodihidrofluoresceína(H2DCF), observamos um aumento de EROs após a captação de Ca2+pela mitocôndria;este aumento de produção de EROs foi estimuladopor Na+ e totalmente revertido pela adição de ADP e CsA, indicando que a PMT promove estresse oxidativo mitocondrial. Este processo pode ser, em parte, explicado pela depleção de NAD(P)H na indução da PMT induzida por Ca2+,em mitocôndrias de cérebro de rato. Sabe-se que NADPH mantém a função antioxidante dos sistemas glutationa redutase/peroxidase e tioredoxina redutase/peroxidase. Além disto, a PMT está associada com a peroxidação lipídica de membrana. Estes resultados indicam que a PMT, decorrente do aumento de EROs induzido por Ca2+em mitocôndrias isoladas de cérebro, leva a danos oxidativos secundários, como a peroxidação lipídica. Para estudar o envolvimento da PMT e proteínas Bcl-2 na excitotoxicidade mediada pelo receptor de glutamato N-metil-D-aspartado (NMDA), foram realizadas em camundongos transgênicos que hiperexpressam Bcl-2 e em ratos, injeções intra-estriatais de ácido
quinolínico, um agonista específico deste receptor. O ácido quinolínico causou uma degeneração de aproximadamente 50% do volume estriatal em ratos e camundongos. Camundongos transgênicos que hiperexpressam a proteína Bcl-2, uma proteína que inibe estímulos apoptóticos, e o tratamento de ratos com CsA não mostraram redução da toxicidade ao ácido quinolínico. Mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados com CsA mostraram resistência à indução de permeabilização induzida por Ca2+, indicando proteção contra a PMT. Concluímos que a excitotoxicidade estriatal mediada por ácido
quinolíniconão é dependente da PMT e da morte celular por apoptose, sensívela Bcl-2. Mudanças na integridade mitocondrial, liberação de ERas e homeostase de Ca2+ estão envolvidas na patogênese de várias desordens neurológicas, incluindo a acidemia metilmalônica e a doença de Huntington (HD). Estas desordens neurodegenerativas cursam com inibição parcial do complexo II da cadeia respiratória itocondrial.Neste trabalho, nós estudamos os mecanismos pelos quais os inibidores do complexo 11 da cadeia respiratória, malonato (MA), metilmalonato (MMA) e 3-nitropropionato (3-NP) afetam a
função mitocondrial e a sobrevivência neuronal in vitro. Observou-se que estes três inibidores, em concentrações que inibem aproximadamente 50% a respiração, induzem permeabilização mitocondrial quando na presença de concentrações micromolares de ci+. ADP, CsA e catalase preveniram este efeito, indicando que é mediado por ERas e PMT.Os efeitos de MA, MMA e 3-NP também foram observados em mitocôndrias isoladas de figado e rim, mas necessitaram uma maior inibição respiratória. Em cérebro, a PMT promovida por inibidores do complexo II foi estimulada pelo aumento da captação/liberação de Ca2+ mitocondrial e foi inibida quando a mitocôndria foi précarregada com Ca2+ou a entrada de Ca2+na matriz mitocondrial foi somente passiva. Em adição aos experimentos com mitocôndrias isoladas, o efeito de MMA também foi estudado em cultura de células PC12 e fatias de estriado de ratos adultos. MMA promoveu morte celular nas fatias de estriado e cultura de células PC12, num mecanismo sensível à
CsA e bongkrekato, e não diretamente relacionado à inibição respiratória. Conclui-se que, em condições em que o complexo II da cadeia respiratória mitocondrial está parcialmente inibidano sistema nervoso central, a morte neuronal envolve a participação da PMT Ver menos
quinolínico, um agonista específico deste receptor. O ácido quinolínico causou uma degeneração de aproximadamente 50% do volume estriatal em ratos e camundongos. Camundongos transgênicos que hiperexpressam a proteína Bcl-2, uma proteína que inibe estímulos apoptóticos, e o tratamento de ratos com CsA não mostraram redução da toxicidade ao ácido quinolínico. Mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos tratados com CsA mostraram resistência à indução de permeabilização induzida por Ca2+, indicando proteção contra a PMT. Concluímos que a excitotoxicidade estriatal mediada por ácido
quinolíniconão é dependente da PMT e da morte celular por apoptose, sensívela Bcl-2. Mudanças na integridade mitocondrial, liberação de ERas e homeostase de Ca2+ estão envolvidas na patogênese de várias desordens neurológicas, incluindo a acidemia metilmalônica e a doença de Huntington (HD). Estas desordens neurodegenerativas cursam com inibição parcial do complexo II da cadeia respiratória itocondrial.Neste trabalho, nós estudamos os mecanismos pelos quais os inibidores do complexo 11 da cadeia respiratória, malonato (MA), metilmalonato (MMA) e 3-nitropropionato (3-NP) afetam a
função mitocondrial e a sobrevivência neuronal in vitro. Observou-se que estes três inibidores, em concentrações que inibem aproximadamente 50% a respiração, induzem permeabilização mitocondrial quando na presença de concentrações micromolares de ci+. ADP, CsA e catalase preveniram este efeito, indicando que é mediado por ERas e PMT.Os efeitos de MA, MMA e 3-NP também foram observados em mitocôndrias isoladas de figado e rim, mas necessitaram uma maior inibição respiratória. Em cérebro, a PMT promovida por inibidores do complexo II foi estimulada pelo aumento da captação/liberação de Ca2+ mitocondrial e foi inibida quando a mitocôndria foi précarregada com Ca2+ou a entrada de Ca2+na matriz mitocondrial foi somente passiva. Em adição aos experimentos com mitocôndrias isoladas, o efeito de MMA também foi estudado em cultura de células PC12 e fatias de estriado de ratos adultos. MMA promoveu morte celular nas fatias de estriado e cultura de células PC12, num mecanismo sensível à
CsA e bongkrekato, e não diretamente relacionado à inibição respiratória. Conclui-se que, em condições em que o complexo II da cadeia respiratória mitocondrial está parcialmente inibidano sistema nervoso central, a morte neuronal envolve a participação da PMT Ver menos
Abstract: Mitochondrial permeability transition (MPT) may be involved in several central nervous system disorders including ischemic and hypoglicemic neuronal death. In this study, we show that Ca2+-induced brain mitochondrial PT was stimulated by Na+ and tota1ly prevented by the combination of ADP...
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Abstract: Mitochondrial permeability transition (MPT) may be involved in several central nervous system disorders including ischemic and hypoglicemic neuronal death. In this study, we show that Ca2+-induced brain mitochondrial PT was stimulated by Na+ and tota1ly prevented by the combination of ADP and cyclosporinA (CsA). Removal of Ca2+ITom the mitochondria suspension by EGTA or inhibition of Ca2+uptake by ruthenium red partia1ly reverted the dissipation ofthe membrane potential associated with PT. Ca2+-inducedbrain mitochondrial PT was significant1yinhibited by catalase, indicating the participation of
reactive oxygen species (ROS) in this processoAn increased detection of ROS, measured through dichlorodihydrotluorescein oxidation, was observed after mitochondrial Ca2+ uptake. Ca2+-induced dichlorodihydrotluorescein oxidation was enhanced by Na+ and prevented by ADP and CsA, indicating that PT enhances mitochondrial oxidative stress. This could be at least in part a consequence of the extensive depletion in NAD(p)H that accompanied Ca2+-inducedbrain mitochondrial PT. NADPH is known to maintain the antioxidant function of the glutathione reductase/peroxidase and thioredoxin
reductase/peroxidase systems. In addition, the occurrence of mitochondrial PT was associated with membrane lipid peroxidation. Our results showed that PT further increases Ca2+-inducedoxidative stress in brain mitochondrialleading to secundary damage such as lipid peroxidation. We studied the participation of PT and the Bcl-2-sensitive apoptotic cell death pathway in glutamate receptor-mediated excitotoxicity. Intrastriatal infusions of the N-methyl-Daspartate (NMDA) receptor agonist quinolinic acid caused massive striatal neurodegeneration in both rats and mice. Interestingly, transgenic mice overexpressing
human Bcl-2 and rats systemica1lytreated with CsA did not exhibit reduced sensitivity to quinolinic acid-induced striatal toxicity. In addition, isolated brain mitochondrial ITom CsA-treated rats showed resistance to Ca2+-induceddissipation ofthe membrane potential, indicating protection against PT. We conclude that quinolinic acid-mediated striatal excitotoxicity is not dependent on PT and Bcl-2-sensitiveapoptotic cell death pathways. Changes in mitochondrial integrity, reactive oxygen species release and Ca2+handling are proposed to be involved in the pathogenesis of many neurological disorders including
methy1malonic acidemia and Huntington's disease (HD), which exhibit partial mitochondrial complex II inhibition. We studied the mechanisms by which the respiratory chain complex II inhibitors malonate (MA), methyl-malonate (MIMA) and 3- nitropropionate (3-NP) affect mitochondrial function and neuronal survival. We observed that all three inhibitors, at concentrations which inhibit respiration by 50%, induced
mitochondrial permeabilization when in the presence of low Ca2+ concentrations. ADP, CsA and catalase prevented this effect, indicating it is mediated by ROS and PT. The effects of MA, MMA and 3-NP were also present in mitochondria isolated ftom liver and kidney, but required more significant respiratory inhibition. In brain, PT promoted by complex II inhIoitors was stimulated by increasing Ca2+ cycling and absent when mitochondria were pre-Ioaded with Ca2+or when only passive Ca2+uptake was present. In addition to the experiments on isolated mitochondria, we determined the effect ofMMA on cultured neural cells model and fteshly prepared brain slices. MMA promoted cell death in striatal slices and PC12 cells, in a manner attenuated by CsA and bongkrekate and unrelated to direct respiratory inhibition. We propose that under conditions in which complex 11is partially inhibited in the central nervous system, neuronal cell death involves the inductionofM PT Ver menos
reactive oxygen species (ROS) in this processoAn increased detection of ROS, measured through dichlorodihydrotluorescein oxidation, was observed after mitochondrial Ca2+ uptake. Ca2+-induced dichlorodihydrotluorescein oxidation was enhanced by Na+ and prevented by ADP and CsA, indicating that PT enhances mitochondrial oxidative stress. This could be at least in part a consequence of the extensive depletion in NAD(p)H that accompanied Ca2+-inducedbrain mitochondrial PT. NADPH is known to maintain the antioxidant function of the glutathione reductase/peroxidase and thioredoxin
reductase/peroxidase systems. In addition, the occurrence of mitochondrial PT was associated with membrane lipid peroxidation. Our results showed that PT further increases Ca2+-inducedoxidative stress in brain mitochondrialleading to secundary damage such as lipid peroxidation. We studied the participation of PT and the Bcl-2-sensitive apoptotic cell death pathway in glutamate receptor-mediated excitotoxicity. Intrastriatal infusions of the N-methyl-Daspartate (NMDA) receptor agonist quinolinic acid caused massive striatal neurodegeneration in both rats and mice. Interestingly, transgenic mice overexpressing
human Bcl-2 and rats systemica1lytreated with CsA did not exhibit reduced sensitivity to quinolinic acid-induced striatal toxicity. In addition, isolated brain mitochondrial ITom CsA-treated rats showed resistance to Ca2+-induceddissipation ofthe membrane potential, indicating protection against PT. We conclude that quinolinic acid-mediated striatal excitotoxicity is not dependent on PT and Bcl-2-sensitiveapoptotic cell death pathways. Changes in mitochondrial integrity, reactive oxygen species release and Ca2+handling are proposed to be involved in the pathogenesis of many neurological disorders including
methy1malonic acidemia and Huntington's disease (HD), which exhibit partial mitochondrial complex II inhibition. We studied the mechanisms by which the respiratory chain complex II inhibitors malonate (MA), methyl-malonate (MIMA) and 3- nitropropionate (3-NP) affect mitochondrial function and neuronal survival. We observed that all three inhibitors, at concentrations which inhibit respiration by 50%, induced
mitochondrial permeabilization when in the presence of low Ca2+ concentrations. ADP, CsA and catalase prevented this effect, indicating it is mediated by ROS and PT. The effects of MA, MMA and 3-NP were also present in mitochondria isolated ftom liver and kidney, but required more significant respiratory inhibition. In brain, PT promoted by complex II inhIoitors was stimulated by increasing Ca2+ cycling and absent when mitochondria were pre-Ioaded with Ca2+or when only passive Ca2+uptake was present. In addition to the experiments on isolated mitochondria, we determined the effect ofMMA on cultured neural cells model and fteshly prepared brain slices. MMA promoted cell death in striatal slices and PC12 cells, in a manner attenuated by CsA and bongkrekate and unrelated to direct respiratory inhibition. We propose that under conditions in which complex 11is partially inhibited in the central nervous system, neuronal cell death involves the inductionofM PT Ver menos
Castilho, Roger Frigério, 1972-
Orientador
Vercesi, Anibal Eugenio, 1946-
Coorientador
Rocha, João Batista Teixeira da
Avaliador
Uyemura, Sergio Akira
Avaliador
Gadelha, Fernanda Ramos, 1964-
Avaliador
Permeabilidade mitocondrial transitoria na excitotoxicidade e na lesão neuronal da acidemia metilmalonica
Evelise Neves Maciel
Permeabilidade mitocondrial transitoria na excitotoxicidade e na lesão neuronal da acidemia metilmalonica
Evelise Neves Maciel
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