Resumo: Atualmente, morte celular por apoptose é objeto de intensa pesquisa devido à
susceptibilidade de células tumorais, incluindo linhagens de células de leucemia e de linfoma, a sofrerem este tipo de morte celular em resposta a determinados agentes anti tumorais. O estresse oxidativo induzido, entre outros fatores, pela diminuição dos níveis de glutationa intracelular, está envolvido no mecanismo de ação de vários compostos, sinalizando as células ao processo apoptótico, envolvendo eventos mediados por cisteino proteases (caspases). Neste estudo, nós examinamos a indução de diferenciação morfológica e morte celular por apoptose pela dimetilamida-crotonina (DCR) em células da leucemia promielocítica humana HL60. A DCR é um derivado sintético da desidrocrotonina (DHC), uma diterpeno lactona extraída das cascas de Croton cajucara, uma planta da região amazônica. A DCR apresentou um efeito inibitório similar ao composto original conforme
avaliado por diferentes parâmetros de citotoxicidade e ambos os compostos induziram diferenciação fenotípica em células HL60. Em contraste, não foram observadas citotoxicidade ou alterações morfológicas associadas com apoptose em linfócitos de sangue periférico humano após tratamento com os compostos em estudo nas concentrações utilizadas (O - 400flM). Com base nas alterações morfológicas, no padrão de &agmentação de DNA e na análise de simetria de membrana de células marcadas com anexina V liodeto de propídeo por citometria de fluxo, DHC e DCR induziram apoptose em células HL60 com a mesma eficiência. Ambos os compostos promoveram a ativação de caspases-2, -6 e -9. A ativação de caspase-9 pela DHC e DCR em células HL60 sugere indução de apoptose através da via mitocondrial. Com o intuito de analisar o possível envolvimento do estresse
oxidativo no mecanismo de toxicidade dos compostos, foram determinados os níveis de glutationa e ocorrência de peroxidação lipídica. O nível de GSH diminuiu cerca de 30% e a produção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) aumentou 4 vezes após o tratamento com ambos os compostos em concentrações próximas ao ICso (250 JlM). A suplementação do meio de cultura com 15 mM de GSH protegeu as células da toxicidade induzida pelos compostos em estudo. Nossos resultados indicam que a DCR e a DHC induzem apoptose em células HL60 em parte pela conjugação com GSH e indução de estresse oxidativo, o qual seria responsável pela peroxidação lipídica e ativação da cascata de caspases através da via mitocondrial. Além disso, resultados de espectroscopia UV Nis sugerem a formação de conjugados entre a GSH e o grupamento O=CH-CH=CH2, presente na DHC e na DCR. Desta forma, os compostos estudados possuem características almejadas para quimioterápicos desencadeando indução de diferenciação morfológica e de apoptose em células da leucemia HL60 Ver menos

Abstract: Apoptosis is subject of intense research due to the susceptibility of tumor cells, including leukemia and lymphom celllines that have been found to undergo this kind of cell death in
response to antitumor agents. The oxidative stress induced, by others factors, by the
decrease of glutathione levels is involved in the action mechanism of several compounds,
signalIing the celIs to apoptotic process, involving events mediated by cystein proteases
(caspases). In this study, we evaluated the morphological differentiation and celI death by apoptosis induction by dimethylamide-crotonin (DCR) in human HL60 promylocitic leukemia cells. The DCR is a synthetic derivative of dehydrocrotonin (DHC), a diterpene lactone isolated ftom the Croton cajucara, an Amazonian planto The dimethylamide crotonin presented a similar inhibitory effect that its parent compound evaluated by different endpoints of cytotoxicity and both compounds induced morphological differentiation on HL60 cells. In contrast, no cytotoxicity or morphological alterations
associated with apoptosis were observed in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after treatment with these studied compounds in the concentrations used (0-400 flM). Based on morphological changes and the pattem of DNA ftagmentation and the symmetry analysis of cell membrane labelIed with annexin V /propidium iodide by flow cytometry, DHC and DCR induced apoptosis on HL60 cells with similar efficiency. Both compounds were effective in triggering the activation of caspase-2, -6 and -9. The caspase 9 activation by DHC and DCR on leukemic cells suggests apoptosis induction by the mitochondrial pathway. In attempt to analyse the possible involvement of oxidative stress on the toxicity action mechanism of these compounds, we determined the GSH levels and lipid peroxidation occurrence. The glutathione levels decreased around 30% and the thiobarbituric acid substance reactive (TBARS) increased 4 times after treatment with both compounds in concentrations around the IC50 value (250 1lM). The culture medium supplementation with 15-mM GSH protected the cells :tIom the toxicity induced by both
compounds. The results indicate that DHC and DCR induce apoptosis on HL60 cells in part
by conjugation with GSH and oxidative stress induction, which could be responsible for lipid peroxidation and caspases activation by the mitochondrial pathway. Moreover, the spectroscopic analyses of DHC or DCR in the presence of GSH 15 mM suggest the conjugate formation between GSH and O=CH-CH=CH2 of DHC or DCR In this way, the studied compounds have the desirable hemotherapic characteristics, triggering cell differentiation and apoptosis Ver menos