Avaliação da expressão genica atraves de tecnica de mRNA differential display em coraçoes de ratos submetidos a sobrecarga pressora aguda
Claudia Raquel Cantarelli Costa
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP C823a
Campinas, SP : [s.n.], 2002.
90 p. : il.
Orientador: Kleber Gomes Franchini
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: Sobrecargas hemodinâmicas induzem hipertrofia e remodeIamento das câmaras cardíacas inicialmente como mecanismo compensatório, evoluindo para insuficiência cardíaca quando as sobrecargas persistem. A resposta inicial à sobrecarga pressora inclui ativação rápida e coordenada de vias de...
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Resumo: Sobrecargas hemodinâmicas induzem hipertrofia e remodeIamento das câmaras cardíacas inicialmente como mecanismo compensatório, evoluindo para insuficiência cardíaca quando as sobrecargas persistem. A resposta inicial à sobrecarga pressora inclui ativação rápida e coordenada de vias de sinalização intracelular que resultam na regulação de fatores nucleares, expressão gêniea e aumento na síntese protéica. A identidade dos vários componentes do mecanismo de sinalização e sua importância relativa para as mudanças fenotípicas dos miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressora permanecem indefinidos. No presente estudo, utilizamos a técnica de mRNA differential display para avaliar a expressão gêniea ampla no ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecargas de pressão por constricção da crossa da aorta com duração de 2 e 4 horas. Inicialmente foram identificados 43 fragmentosde cDNA-candidatos que apresentaram aumento de expressão em ventrículos esquerdos sobrecarregados. Estes fragmentos foram então reamplificados, clonados, seqüenciados e identificados através de comparações com seqüências depositadas no GenBank. Foram identificados 5 seqüências homologas com genes já identificados. Um gene em especial, aquele que codifica a quinase TBKl, despertou nosso interesse por seu envolvimento potencial na regulação de vias que controlam a atividade do fator de transcrição NF-kB, conhecido por coordenar processos celulares fundamentais em resposta a estímulos de diversas naturezas. Assim, na avaliação subseqüente da TBKl, confirmamos o aumento de sua expressão no miocárdio através da técnica de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para o TBKl aplicada a RNA total obtido de ventrículos esquerdos submetidos a 2 e 4 horas de sobrecarga pressora e de ratos controle. Os resultados deste experimento confirmaram o aumento na expressão de TBKl no miocárdio em resposta à sobrecarga de pressão. Em seguida, avaliamos a expressão e localização da TBKl no ventrículo esquerdo através de técnicas de Westem Blot, fracionamento de componentes citoplasmáticos e citosólico através de ultracentrifugação diferencial e imunohistoquímica. Verificamos que a quinase TBKl se expressa tanto no miocárdio e em miócitos cardíacos como em células da camada média das artérias coronárias e que sua quantidade no miocárdio aumenta significativamente cerca de 2 horas até 24 horas após o início da sobrecarga pressora. Experimentos realizados com marcação do anticorpo anti-TBKl em extratos nucleares e citosólicos revelaram a presença de TBKl na fração nuclear dos miocárdios, com aumento significativo neste extrato após cerca de 30 minutos de hipertrofia e permanecendo elevada até 24 horas de sobrecarga pressora. Experimentos de co-imunoprecipitação indicaram que a TBKl se associa com o NF-kB e que esta associação aumenta no miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Experimentos de quinase in vitro utilizando imunoprecipitados de TBKl e NF-kB indicaram que o imunocomplexo do anticorpo anti-TBKl induz a fosforilação do NF-kB e que este efeito está aumentado no miocárdio de corações sobrecarregados. Foram também realizados experimentos para avaliar a expressão, localização e atividade do fator de transcrição NF-kB. Experimentos com extratos nuclear e citosólico do miocárdio indicaram a translocação do NF-kB para o núcleo induzida pela sobrecarga pressora. Estes resultados foram corroborados pela detecção de marcação mais intensa de núcleos com o anticorpo anti-NF-kB nos miócitos cardíacos de corações sobrecarregados. Finalmente, experimentos realizados com extratos nucleares em ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) indicaram a ativação da ligação do NF-kB com o DNA de sondas contendo a região de consenso para este fator em miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Nossos resultados indicaram 1) que a técnica de mRNA differential display permitiu a avaliação, apesar de restrita, de genes expressos diferencialmente durante sobrecarga pressora; 2) que a quinase TBKl é ativada e pode ter papel importante na ativação do fator de transcrição NF-kB nos períodos iniciais de resposta miocárdica à sobrecarga pressora; 3) o fator de transcrição NF-kB é ativado precocemente e permanece ativado até 24 horas no miocárdio de ratos submetidos a sobrecarga pressora, indicando uma função potencial deste fator nos processos responsáveis pela resposta das células miocárdicas à sobrecarga hemodinâmica
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Abstract: To examine genes that are early differentially expressed in response to pressure overload we performed differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction on samples of rat left ventricle (LV) subjected to 2 and 4 hours of transverse aortic constriction. Specifically, we...
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Abstract: To examine genes that are early differentially expressed in response to pressure overload we performed differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction on samples of rat left ventricle (LV) subjected to 2 and 4 hours of transverse aortic constriction. Specifically, we identified increased expression of five genes out of 43 candidate-cDNA ftagments. One such a gene, TBKI raised our interest because of its potential role on the regulation of pathways that control the activity of the transcription factor NF-kB, known to coordinate fundamental cellular processes in response to stressful stimuli. RT-PCR analysis with TBKI-specific primers in LV samples confirmed the enhanced expression of transcripts of TBKI in overloaded myocardium. To verify the functional significance of such finding we first examined TBKI expression in LV by immunoblot and immunohistochemical analysis. TBKI protein levels increased at 2 and remained elevated up to 24 hs of pressure overload. The immunostaining analysis showed TBKI expressed predominantly in cardiac myocytes and in the media of coronary vessels. Co-immunoprecipitation experiments indicated a load-induced increase in the association of TBKI with p50NF-kB that was paralleled by enhanced anti-TBKI immunocomplex kinase activity toward p50NF-kB. Experiments with myocardial nuclear and cytosolic extracts indicated a load-induced p50NF-kB translocation from cytosolic to nuclear fraction and increases in DNA-binding activity demonstrated by electrophoretic mobility shift assay, concurrent with increased TBKI expression and p50NF-kB phosphorylation by anti- TBKI immunoprecipitates. These results suggest that TBKI is rapidly activated and might regulate NF-kB in overloaded myocardium with potential implications in load-induced cardiac hypertrophy and remodeling
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