Purificação de anticorpos monoclonais anti-TNP do isotipo IgG1 utilizando cromatografia em membranas de afinidade com ions metalicos imobilizados
Gisele Serpa
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP Se67p
Campinas, SP : [s.n.], 2002.
105p. : il.
Orientador: Sonia Maria Alves Bueno
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Resumo: Anticorpos monoc1onais são imunoglobulinas secretadas por uma célula híbrida, chamada hibridoma, que é fonnada pela fusão de um linfócito (produtor de anticorpos) e uma célula de mieloma, o que faz do hibridoma uma célula produtora de anticorpos virtualmente imortal. Os anticorpos...
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Resumo: Anticorpos monoc1onais são imunoglobulinas secretadas por uma célula híbrida, chamada hibridoma, que é fonnada pela fusão de um linfócito (produtor de anticorpos) e uma célula de mieloma, o que faz do hibridoma uma célula produtora de anticorpos virtualmente imortal. Os anticorpos monoc1onais têm sido utilizados nas áreas analítica e terapêutica, o que implica na necessidade de obtenção de anticorpos de alta pureza. Muitos estudos têm sido realizados visando a purificação de anticorpos monoc1onais, e destacam-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, hidrofóbicas e de a:f11Údade. Neste trabalho aplicou-se a cromatografia em membranas de álcool polietileno-vinílico, derivatizadas com ácido iminodiacético (IDA), com íons metálicos imobilizados na purificação de anticorpos monoc1onais IgGl a partir de sobrenadante de cultura celular. Para determinar as melhores condiçôes de adsorção e eluição, foram testados os íons Cu2+, Ni2+, Zn2+ e C02+, na presença de diferentes sistemas tamponantes. A seletividade dos metais, em cada um dos sistemas, foi determinada através de eletroforese SDS-PAGE e testes ELISA das frações dos picos de proteína obtidos. A melhor condição de purificação foi a alimentação de sobrenadante de cultura celular previamente precipitado e dialisado com solução de sulfato de amônio, em coluna contendo PEVA-IDA-Zn2+, em presença de tampão Tris-HCI 50 mM a pH 7,0 e eluição por aumento de concentração de Tris. A partir das isotermas de adsorção, determinou-se a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação do complexo IDAZn2+-IgGl que de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir, mostraram uma alta capacidade de adsorção (63,4 mg/g de membrana seca) e uma constante de dissociação (8,lxlO-6 M) característica de sistemas de média afinidade. Foram também determinadas as curvas de ruptura para o processo proposto, através de experimentos de fIltração a diferentes vazões de alimentação, utilizando um módulo contendo as fibras ocas com Zn2+ imobilizado, construído em nosso laboratório
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Abstract: Monoc1onal antibodies are immunoglobulins produced by a hybrid cell ca11ed hybridoma. These cells result from the fusion of lymphocytes with malignant myeloma cells. Hybridomas cells express both the lymphocyte's property of specific-antibody production and the immortal character of the...
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Abstract: Monoc1onal antibodies are immunoglobulins produced by a hybrid cell ca11ed hybridoma. These cells result from the fusion of lymphocytes with malignant myeloma cells. Hybridomas cells express both the lymphocyte's property of specific-antibody production and the immortal character of the myeloma cells. Monoc1onal antibodies have been used in analy1ica1 and therapeutica1 areas. This application needs high1y pure antibodies. Many techniques have been studied focusing monoc1onal antibodies purification. These techniques inc1ude ion exchange, hydrophobic and affinity chromatography. In this study, we applied polyethylenevinyl alcohol (PEV A) membranes in the purification of monoc1onal antibody from cell culture supem.atant. These membranes were derivatized with the quelant agent, iminodiacetic acid (IDA). We evaluated the adsorption and purification of monoc1onal antibodies on the matrix with different immobilized metal ios, Cu2+, Ni2+, Zn2+ and C02+ and with different buffers. According to SDSPAGE electrophoresis and ELISA analysis, the higher selectivity was obtained in the presence of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,0 and with elution by increasing Tris concentration, with immobilized Zn2+, wich provided the purification of IgG with traces of albumin. The adsorbent capacity and the dissociation constant of the complex IDA-Zn2+-IgGI were determinated from adsorption isotherms. According to the Langmuir model, the results indicated that the matrix presents high adsorption capacity (63,4 mg/g de chy membrane) and a dissociation constant (8,1 x 10-6 M) characteristic for intermediate affinity systems. We also evaluated the breaktrough curves for PEVA-IDA-Zn2+ membrane chromatography for the antibodies purification using different flow rates. These breaktrough CUIVes are important to sca1e up procedure
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Purificação de anticorpos monoclonais anti-TNP do isotipo IgG1 utilizando cromatografia em membranas de afinidade com ions metalicos imobilizados
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