Caracterização da resposta fisiologica de plantas citricas a infecção pelo virus da tristeza
Celia Regina Baptista Grassi
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP G769c
Campinas, SP : [s.n.], 2002.
86p. : il.
Orientador: Jorge Vega
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Esta tese teve como objetivos caracterizar as alterações histológicas e fisiológicas induzidas em plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego', inoculadas com isolados fracos (Pera IAC e Isolado 50) e severos (Pera Rio e Barão B) do vírus da tristeza dos citros (CTV); estudar as respostas das...
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Resumo: Esta tese teve como objetivos caracterizar as alterações histológicas e fisiológicas induzidas em plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego', inoculadas com isolados fracos (Pera IAC e Isolado 50) e severos (Pera Rio e Barão B) do vírus da tristeza dos citros (CTV); estudar as respostas das plantas à infecção pelo CTV quanto à variação de atividades enzimáticas envolvidas na reação da planta (PAL, CAD, Peroxidases ligadas à parede celular POX-lig); obter dados sobre a localização a nível morfo-histológico de peroxidases ligadas à parede celular; obter dados sobre isoenzimas de peroxidases envolvidas na resposta à infecção pelo CTV; caracterizar a resposta das plantas à infecção pelo CTV quanto a alterações no conteúdo de ácido salicílico total. Para tanto, plantas de laranja 'Pera¿ e limão 'Galego¿ foram inoculadas por união de tecido com borbulhas de plantas infectadas com os isolados do vírus. Como controle foram usadas plantas enxertadas com borbulhas sadias. As plantas foram mantidas em casa de vegetação. Nos experimentos onde determinou-se a atividade das enzimas PAL,CAD e Pox-lig foi verificado, com exceção da enzima CAD, que plantas infectadas pelos isolados severos do CTV apresentaram um aumento significativo na atividade dessas enzimas, enquanto que as plantas infectadas pelos isolados fracos do virus diminuíram a atividade ou não a modificaram. Quando guaiacol e siringaldazina, substratos específicos para determinar a atividade de peroxidases foram usados, observou-se que a atividade de guaiacol peroxidase não apresentou correlação com a severidade do isolado do CTV. As diferenças observadas na atividade de siringaldazina peroxidase foram de tal magnitude que poderiam ser consideradas na prática como um parâmetro na diferenciação entre isolados fracos e severos do CTV. A enzima CAD não foi estimulada pela infecção com os diferentes isolados do CTV, não foram observadas diferenças nas atividades entre a plantas infectadas com vírus e plantas sadias. Assim como na Pox -lig e P AL, o conteúdo de ácido salicilico foi mais elevado somente nas plantas infectadas pelos isolados severos do vírus. Plantas infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram teores de SA duas vezes mais elevados que as plantas sadias e 2,7 e 4,4 vezes o valor de plantas infectadas com os isolados Pera IAC e Galego 50, respectivamente. Nos experimentos de eletroforese as isoperoxidases foram separadas em gel ácido (pH 4,5) e gel alcalino (pH 8,3). Em gel alcalino utilizando carbazole como substrato genérico para peroxidases, observou-se duas bandas peroxidases citoplasmáticas nos materiais infectados com isolados severos, enquanto que com o isolado fraco e plantas sadias apresentaram apenas uma banda. Em pH ácido, utilizando siringaldazina como substrato, apenas uma peroxidase de parede celular foi detectada em plantas infectadas pelos isolados severos do CTV. Plantas sadias e infectadas com isolados fracos do vírus não apresentaram atividade. A análise da atividade de guaiacol peroxidase através de fracionamento por HPLC mostrou que as plantas infectadas com o isolado severo do CTV apresentaram dois picos de atividade, sendo o primeiro aos 16-17 minutos de eluição com atividade em tomo de 0,02 ?Abs / mino e o segundo pico, aos 19,5 mino de eluição, com atividade bem maior, em tomo de 0,09 ?Abs / min. Por outro lado, plantas sadias e plantas infectadas com isolado fraco do vírus apresentaram apenas um pico de atividade aos 20 mino de eluição com atividade ao redor de 0,04 e aos 21 min. de eluição com atividade ao redor de 0,06 ?Abs / min, respectivamente. Nos ensaios de microscopia de fluorescência, plantas de limão' Galego' infectadas pelo isolado severo Barão B apresentaram depressões no xilema que foram visualizadas quando utilizou-se excitação com luz UV (Fig. 13 a). O material apresentou fluorescência amarela com excitação por luz azul (Fig. 13 b). Em plantas sadias e plantas infectadas pelo isolado fraco Galego 50 não foram observadas alterações na fluorescência na região do floema e do câmbio vascular (Fig. 13 c,d, respectivamente). Em plantas de laranja 'Pera' infectadas pelos isolados severos Barão B e Pera Rio, foi observado um acúmulo de material fluorescente verde na região do câmbio vascular. o trabalho permite concluir que a atividade de peroxidase associada à lignificação (Pox-lig) pode ser considerada como um parâmetro bastante significativo para a diferenciação de isolados fracos e severos do CTV. Os isolados severos do vírus causam aumento na atividade de enzimas envolvidas nas reações de defesa das plantas, concomitante com o aumento no teor de SA, que atua como molécula sinalizadora. Plantas infectadas pelos isolados severos apresentam disfunção do floema, na região do câmbio vascular e também o aparecimento de uma proteína com atividade peroxidásica que pode ocorrer através de síntese de novo (ativação gênica) ou por ativação de proteína preexistente
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Abstract: The present work had as objective the characterization of physiological and histological alterations induced in 'Pera' sweet orange and 'Mexican' lime plants infected by severe (Pera Rio and Barão B) or mild (pera IAC and Isolado 50) isolates of citrus tristeza virus (CTV). The response of...
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Abstract: The present work had as objective the characterization of physiological and histological alterations induced in 'Pera' sweet orange and 'Mexican' lime plants infected by severe (Pera Rio and Barão B) or mild (pera IAC and Isolado 50) isolates of citrus tristeza virus (CTV). The response of plants to CTV infection was examined in relation to changes in enzymatic activities associated with the reaction of the plant to virus infection: P AL, CAD and cell wall-associated peroxidase (Pox-lig). Also examined were the content of salicylic acid, the histological localization of cell wall-associated peroxidases and their electrophoretic characteristics. All the experiments were conducted in 'Pera' orange and 'Mexican' lime plants, graft-inoculated with the different CTV isolates. As healthy controls, plants graft inoculated with healthy scions were used. The plants were kept in the greenhouse during the experiments. Two enzymes, P AL and cell wall-associated peroxidase, have their activity significantly increased in plants infected by severe CTV isolates. These enzyme activities were reduced or not changed by infections with mild isolates, as compared to healthy controls. This correlation between activity and severity of the virus isolate was not observed when guaiacol was used as generic substrate in the peroxidase assay. However, using syringaldazine as substrate for cell wall-associated peroxidase (Pox-lig), the correlation was evident. The differences in syringaldazine-peroxidase and in P AL activities were of such magnitude that they may be useful as a parameter in differentiating mild and severe isolates. The activity of the enzyme CAD was not changed by CTV infection, whether of severe or mild isolates. Paralleling the activity of Pox-lig, the content of salicylic acid was also increased only in plants infected by severe CTV isolates. 'Pera' oranges infected with the severe isolate "Barão B" had 2,7 and 4,4 times greater content of SA than plants infected with "Pera IAC" or "Galego 50" mild isolates, respectively. Using non-denaturing PAGE electrophoresis at an alkaline pH (pH 8.3) an additional band was detected only in plants infected with severe isolates. At acid pH (pH 4.5) it was possible to detect one band with syringaldazine-peroxidase activity only in plants infected with severe isolates. Separation of isoenzymes by HPLC showed an additional peak of guayacol activity (0.02 ?Abs /min) eluting at 16-17 minutes, which was absent in healthy or mild isolate-infected materiais. At 19.5-21 minutes eluted a peak of greater activity (0.09 ?Abs /min) that was common to infected and healthy materiais. Fluorescence microscopy of stem tips of 'Mexican' lime plants, infected with the severe isolate Barão B, showed depressions in the xylem, visualized using UV excitation light. With blue light excitation it was possible to visualize a yellow fluorescing material within the xylem depressions (Figs. 13 a and b). In healthy or mild isolate (Galego 50) materials, fluorescence alterations were not observed in the cambium zone. In 'Pera' orange plants infected with severe isolates (Barão B and Pera Rio) the accumulation of green-fluorescent material was observed in the cambium zone when UV excitation was used. It may be concluded that peroxidase activity associated with lignification can be considered as a significant parameter to differentiate severe from mild isolates of CTV. Severe isolates of CTV induce increases in enzyme activities involved in plant defense mechanisms, paralleling the increase of salicylic acid content, which functions as signaling molecule. Plants infected by severe isolates show disfunctional phloem and an altered cambium zone. They also show the appearance of a new band with peroxidasic activity that may arise from de novo synthesis (gene activation) or from activation of a pre-existing protein
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Caracterização da resposta fisiologica de plantas citricas a infecção pelo virus da tristeza
Celia Regina Baptista Grassi
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