Otimização, isolamento, identificação e atividade antiproliferativa da violaceina obtida por processo fermentativo
Armando Semedo Mendes
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP M522o
Campinas, SP : [s.n.], 2002.
186p. : il.
Orientador : João Ernesto de Carvalho
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A violaceína é um pigmento produzido pela bactéria Chromobacterium violaceum e estudada por vários grupos de pesquisadores mundialmente, sendo já relatada as seguintes atividades biológicas para este pigmento: bactericida (Durán 1990), tripanocida (Caldas et aI. 1978; Durán et al. 1989;...
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Resumo: A violaceína é um pigmento produzido pela bactéria Chromobacterium violaceum e estudada por vários grupos de pesquisadores mundialmente, sendo já relatada as seguintes atividades biológicas para este pigmento: bactericida (Durán 1990), tripanocida (Caldas et aI. 1978; Durán et al. 1989; Durán & Haun, 1991), anti-viral (May et al. 1991), tumoricida (Durán et al. 1996), atividade citotóxica em células de mamíferos (Durán et aI. 1989; Haun et al. 1992), antioxidante (De Azevedo et al 2000), indução de apoptose (MeIo et al. 2000) e antifúngica (Shirata et aI. 2000). No entanto, no atual estágio de desenvolvimento, ela ainda não entrou na fase clínica.O requerimento nutricional da C. violace um necessário para aumentar a produção de violaceína tem sido estudado desde 1913 utilizando técnicas clássicas univariadas. Ao longo das décadas um número de fatores nutricionais foram relatados como sendo importantes para a produção de violaceína, tais como glicose (Kimmel & Maier 1969, Duran et al. 1994), extrato de levedura, DL-metionina, vitamina B12, peptona (DeMoss & HappeI1959), Zn+2(Hoshino & Yamamoto 1997), L-triptofano (DeMoss & Evans 1959, Kimmel & Maier 1969), temperatura, agitação, pH (DeMoss & Evans 1959, Riveros et aI. 1989) entre outros. Além dos fatores físicos e nutricionais, a produção de violaceína pelo C. violaceum, depende da cepa utilizada e existem poucos trabalhos que relatam a produção volumétrica (nmol mL-1 h-1) deste pigmento. A cepa ATCC 553 utilizada por DeMoss & Happel (1959) tinha uma taxa de produção de violaceína de 0,47 nmol mL-1 h-1. Riveros et al. (1989) utilizou a cepa BB-78 e obteve uma taxa de produção de 4.0 nmol mL-1 h-1. A cepa CCT 3496 utilizada neste trabalho tinha uma produção de 13.75 nmol mL-1 h-1 antes da otimização. Esses valores podem ser aumentados, contudo a determinação dos níveis dos fatores otimizados por técnicas padrões univariadas nem sempre são possíveis para tais sistemas complexos. Um dos objetivos deste trabalho foi determinar os valores dos fatores otimizados para aumentar a produção de violaceína e massa celular pela aplicação de grupos de planejamentos planejados estatisticamente. Esses experimentos multivariados são desenhados para reduzir o número de experimentos necessários no processo de otimização e produzir resultados mais precisos que aqueles obtidos por estratégias univariadas (Barros Neto et aI. 1996, Box et al. 1978). Com utilização de planejamentos estatísticos é possível a otimização de um sistema mesmo quando os mecanismos fundamentais envolvidos no processo de investigação não são conhecidos. A primeira fase deste trabalho, envolveu um planejamento fracionário ideal para triagem simultânea de fatores, onde foram estudados 11 fatores (glicose, extrato de levedura, peptona, DL-metionina, vitamina B12, L-triptofano, agitação, temperatura, inóculo, Zn+2e pH). Destes 11 fatores, 5 fatores (glicose, extrato de levedura, peptona, L-triptofano e Zn+2) foram considerados como os mais importantes para aumentar a produção simultânea de violaceina e massa celular. Assim, um planejamento composto central de cinco fatores foi utilizado para este propósito. Neste estágio, conseguiu-se aumentar os valores médios de produção de 5,19 g/L (biomassa) e 0,11 g/L (violaceína bruta) no planejamento fracionário para 7,47 g/L (biomassa) e 0,23 g/L (violaceína bruta) utilizando um planejamento composto central com 5 fatores. Com base neste último planejamento, utilizou-se os fatores mais importantes (glicose, L-triptofano e extrato de levedura) e realizou-se um planejamento composto central com três fatores. Como resultado obteve-se 16,59 g/L (biomassa) e 0,36 g/L (violaceína bruta), o que representa um aumento de mais 100% e 50%, respectivamente em relação ao planejamento fracionário. Este trabalho mostra que aumentos de metabólitos secundários, por qualquer microrganismo, podem ser conseguidos utilizando estas técnicas multivariadas. A última fase deste trabalho envolveu testes de triagem farmacológica, que foram realizados com oito linhagens de células de tumores sólidos. Estes demonstraram que o extrato semi-purificado de violaceína por cristalização (ESPVC), apresentou efeitos de autocitoproteção celular concentração-dependente, em concentrações acima de 0,25 µg/mL sobre algumas linhagens celulares, principalmente com relação as células de tumores de mama (NCI-ADR) e de melanoma (UACC62)
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Abstract: The violacein is a pigment produced by the bacterium Chromobacterium violaceum and studied by several groups researcher worldwide, the following pharmacological activities have been described for this pigment: bactericidal (Durán 1990), tripanocidal (Caldas et aI. 1978; Durán et aI. 1989;...
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Abstract: The violacein is a pigment produced by the bacterium Chromobacterium violaceum and studied by several groups researcher worldwide, the following pharmacological activities have been described for this pigment: bactericidal (Durán 1990), tripanocidal (Caldas et aI. 1978; Durán et aI. 1989; Durán & Haun, 1991), anti-viral (May et aI. 1991), tumoricidal (Durán et aI. 1996), activity cytotoxic in cells of mammals (Durán et aI. 1989; Haun et aI. 1992), antioxidant (De Azevedo et aI. 2000), apoptosis induction (MeIo et aI. 2000) and antifungal (Shirata et aI. 2000). However, the drug development stage has yet to enter clinical studies. The nutritional requirements of C. violaceum necessary to increase violacein production has been studied since 1913 using classical univariate techniques. Along these decades a large number of nutritional factors and physical parameters have been reported as being important for the violacein production, such as glucose (Kimmel & Maier 1969, Duran et aI. 1994), yeast extract, DL-methionine, vitamin B12,peptone (DeMoss & Happel 1959), Zn+2(Hoshino & Yamamoto 1997), L-tryptophan (DeMoss & Evans 1959, Kimmel & Maier 1969), temperature, agitation, pH (DeMoss& Evans 1959, Riveros et aI. 1989) among others. Besides physical and nutritional factors, the violacein production by C. violaceum, depends on the strain used and few studies relate the volumetric production (nmol mL-1 h-1) of this pigment.The ATCC 553 strain used by DeMoss & Happel (1959) has a 0,47 nmol mL-1 h-1 rate of violacein production. Riveros et aI. (1989) used a BB-78 strain and obtained a 4.0 nrnol mL-1h-1 production rate. The CCT 3496 strain used in this work had a 13.75 nmol mL-1 h-1 production rate before optimization. These values can be increased, however the determination optimized factor levels by standard univariate techniques is not always feasible for such complex system. One of the aims of this work was to determine optimized values in order to increase violacein yield employing statistically planned experiments groups. These multivariate experiments are designed to reduce the number of experiments necessary in the optimization process and to produce more precise results than those obtained by univariate strategies (Barros Neto et aI. 1996,Box et al 1978). Statistical designs result in successful optimizations even if a fundamental understanding of the mechanisms involved in the process under investigation is lacking. The first stage of this work, involved a fractional design ideal for simultaneous factor screening. In this work eleven factors where studied (glucose, yeast extract, peptone, DLmethionine, vitamin B12,L-tryptophan, agitation, temperature, inoculum, Zn+2 and pH). Of these, 5 factors (glucose, yeast extract, peptone, L-tryptophan and Zn+2)were considered as the most important to increase the simultaneous production ofviolacein and cellular mass. For this purpose a central composition design of five factors was used. In this stage, an increase of production medium values of 5,19 g/L (biomass) and 0,11 g/L (crude violacein) in the fractional design for 7,47 g/L (biomass) and 0,23 g/L (crude violacein) using a central composite design with 5 factors was used. Based on the most promising factor levels (glucose, L-tryptophan and yeast extract) found for this factors, a final central composition design considering only three factors were used. As result an 100% yield of biomass was obtained (16,59 g/L) and 50% of crude violacein (0,36 g/L) employing fractional planning. This work showed that these multivariant techniques increases secondary metabolites production with any microorganism employed. The last stage of this work involved pharmacological screening with eight lineages solid tumors strains. These demonstrated that the semi-purified violacein extracts (ESPVC), revealed concentration-dependent cellular autocy to protective effect, for concentrations above 0,25 mg/mL on some cellular strains, mainly on mamma tumors (NCI-ADR) and of melanoma strains(UACC62)
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Otimização, isolamento, identificação e atividade antiproliferativa da violaceina obtida por processo fermentativo
Armando Semedo Mendes
Otimização, isolamento, identificação e atividade antiproliferativa da violaceina obtida por processo fermentativo
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