Resumo: Nesta Tese, estudamos o transporte de Ca2+ em esferoblastos permeabilizados de Candida parapsilosis preparados por uma nova técnica utilizando-se a enzima liticase. Caracterizou-se um mecanismo de captação de Ca2+ intracelular não mitocondrial, insensível ao ortovanadato porém sensível ao inibidor de V-H+-ATPase bafilomicina A1, nigericina e FCCP. A acidificação deste compartimento, no qual o Ca2+ é acumulado, foi acompanhada utilizando-se o corante fluorescente alaranjado de acridina. A acidificação interna foi estimulada pelo quelante de Ca2+ EGTA e inibida por Ca2+. Esses resultados adicionados ao fato de que o Ca2+ induz a alcalinização deste compartimento sugerem fortemente a presença de um antiporter Ca2+/nH+ na membrana deste compartimento ácido. Uma outra observação interessante foi o fato de que, assim como nos tripanossomatídeos, o composto antioxidante BHT inibe a V-H+-ATPase. Além disso, o agente antifúngico cetoconazol promoveu uma rápida alcalinização desse compartimento ácido de maneira dose-dependente e na mesma faixa de concentração encontrada no plasma sangüíneo de pacientes tratados com essa droga. Uma proteína desacopladora (UCP) foi identificada em mitocôndrias de C. parapsilosis (CpUCP), uma levedura não-fermentativa. A atividade da CpUCP, investigada em mitocôndrias livre de ácidos graxos, foi estimulada por ácido linoléico (LA) e inibida por GTP. A atividade da CpUCP, após a adição de LA, foi verificada pelo aumento da respiração em estado 4, devido ao decréscimo no DY e à diminuição da razão ADP/O dissipando assim, a energia da oxidação fosforilativa. Essa dependência de voltagem do fluxo de elétrons indica que o LA teve um efeito puramente protonofórico. A descoberta da CpUCP demonstra que as proteínas tipo UCP ocorrem em pelo menos quatro reinos eucarióticos: animal, vegetal, fungos e protista. s mitocôndrias de C. parapsilosis possuem uma oxidase alternativa (AOX) constitutiva, além da cadeia respiratória clássica (CRC) e da cadeia respiratória paralela (PAR), ambas terminado em citocromo c oxidases diferentes. A AOX da C. parapsilosis foi identificada imunologicamente e verificou-se que a mesma apresenta uma regulação tipo-fúngica na qual o GMP age como estimulador e o LA como inibidor. A análise da inibição da respiração, através da determinação da razão ADP/O e da respiração em estado 3, demonstraram que (i) o oxigênio pode ser reduzido pelas três oxidases terminais através das quatro vias respiratórias, implicando em uma interligação entre CRC e PAR, (ii) a somatória das capacidades da CRC, AOX e PAR é maior do que a respiração total (sem aditividade) e seu aumento pode ser progressivo dependendo do estado redox da ubiquinona, primeiro via dos citocromos, depois AOX e finalmente PAR. Através dessas evidências, foi proposto nesta tese um novo modelo para a cadeia respiratória de C. parapsilosis Ver menos

Abstract: In this thesis, we studied Ca2+ transport in permeabilized Candida parapsilosis spheroblasts prepared by a new technique using lyticase. An intracellular non-mitochondrial Ca2+-uptake pathway, insensitive to orthovanadate and sensitive to the V-H+-ATPase inhibitor bafilomycin A1, nigericin and FCCP was characterized. Acidification of this Ca2+ compartment was followed using the fluorescent dye acridine orange. Acidification was stimtlated by the Ca2+ chelator EGTA and inhibited by Ca2+. These results, when added to the observation that Ca2+ induces alkalization of a cellular compartment, provided evidence for the presence of a Ca2+/nH+ antiporter in the acidic compartment membrane. Interestingly, like in the acidocalcisomes of trypanosomatids, the antioxidant BHT inhibits the V-H+-ATPase. In addition, the antifungal agent ketoconazole promoted a fast alkalization of this acidic compartment. Ketoconazole effects were dose-dependent and occurred in a concentration range close to that attained in the blood plasma of patients treated with this drug. An uncoupling protein (UCP) was identified in mitochondria from C. parapsilosis (CpUCP), a non- fermentative parasitic yeast. Activity of CpUCP, investigated in mitochondria depleted of free fatty acids, was stimulated by linoleic acid (LA) and inhibited by GTP. Activity of CpUCP enhanced state 4 respiration by decreasing YDand lowered the ADP/O ratio. Thus, it was able to divert energy from oxidative phosphorylation. The voltage dependence of electron flux indicated that LA had a pure protonophoretic effect. The discovery of CpUCP proves that UCP-like proteins occur in four eukaryotic kingdoms: animals, plants, fungi and protists. We have also demonstrated that mitochondria of C. parapsilosis contain a constitutive ubiquinol alternative oxidase (AOX) in addition to a classical respiratory chain (CRC) and a parallel respiratory chain (PAR) both terminating by two different cytochrome c oxidases. The C. parapsilosis AOX is characterized by a fungi-type regulation by GMP (as a stimulator) and linoleic acid (as an inhibitor). Inhibitor screening of the respiratory network by the ADP/O ratio and state 3 respiration determinations showed that (i) oxygen can be reduced by the three terminal oxidases through four paths implying one bypass between CRC and PAR, (ii) the sum of CRC, AOX and PAR capacities is higher than the overall respiration (no additivity) and that their engagement could be progressive according to the redox state of ubiquinone, i.e. first cytochrome pathway, then AOX and finally PAR Ver menos