Influencia de alterações conformacionais na atividade da fosfatase acida de sementes quiescentes de soja
Alexandre Donizeti Martins Cavagis
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP C313i
Campinas, SP : [s.n.], 2001.
58p. : il.
Orientador : Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura....
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Resumo: O objetivo central do presente trabalho foi avaliar a estabilidade conformacional da fosfatase ácida de sementes quiescentes de soja. Através de estudos de desnaturação térmica, verificou-se uma temperatura de transição (TM) de 65 oC que mostra uma resistência incomum frente à temperatura. Observaram-se efeitos da concanavalina A (lectina) e de molibdato (inibidor) no perfil de desnaturação enzimática com alterações na TM. A desnaturação enzimática por dodecilsulfato de sódio (SDS) foi muito pouco significativa em presença do fosfoenolpiruvato (PEP) como substrato. Essa insensibilidade ao agente desnaturante pode ser explicada pela alta afinidade apresentada pela fosfatase em relação ao substrato em questão. A desnaturação térmica da enzima em presença do PEP revelou que este substrato produz uma mudança significativa no perfil de desnaturação, induzindo uma diminuição na temperatura de transição (TM) que representa um efeito antagônico àquele observado na desnaturação por SDS. A análise de aminoácidos revelou informações valiosas que explicam propriedades como o pI relativamente baixo (5,0), e o número expressivo de resíduos ácidos pode estar relacionado à estabilidade conformacional da enzima. Os estudos sistemáticos da desnaturação reversível por uréia e cloreto de guanidínio (GuaCl) foram realizados utilizando-se a fluorescência como técnica de monitoramento. O cálculo da Estabilidade Conformacional (deltaG H2O) foi feito tomando-se os deslocamento nos comprimentos de onda de máxima emissão de fluorescência como parâmetro e o valor obtido foi de 2,48 kcal/mol -1. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos. A análise de carboidratos, realizada por HPLC revelou a presença de manose, glicosamina e galactosamina e a remoção da fração de carboidratos não foi possível mesmo após tratamento com 300 mU das endoglicosidases endo-H, endo-F e endo-F1
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Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high...
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Abstract: The central aim of the present work was to evaluate the conformational stability of an isoform of soybean seeds acid phosphatase. Through thermal denaturation studies, the transition temperature (TM) value determined (65 oC), indicated an unusual resistance of the enzyme under high temperatures. Effects of strongly binding compounds such as concanavalin A (lectin) and molybdate (inhibitor) on the denaturation profile and transition temperature values were also observed. Enzymatic denaturation by sodium dodecyl sulfate (SDS) was insignificant in presence of phosphoenolpyruvate (PEP) which might be explained by the high affinity of the enzyme for this substrate. Thermal denaturation studies in presence of PEP showed both a significant change on the denaturation profile and a reduction on the transition temperature value. Aminoacid analysis contributed to important informations that are in accordance with some properties of the enzyme such as the relatively low isoelectric point (pI): 5.0. Furthermore, the expressive number of acid residues seems to be related to the conformational stability of the polypeptidic chain. Systematic studies of reversible denaturation by urea and guanidinium chloride (GuaCl) were carried out using fluorescence as a monitoring technique. Conformational Stability calculations were made based on the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a parameter and the value obtained was 2.48 kcal.mol-1. Calculations of the centre of mass were made as a function of the denaturating agent concentration in both cases. Carbohydrate analysis was carried out by using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) revealed mannose, glucosamine and galactosamine as main carbohydrates in the glycoconjugated structure. Carbohydrate removal was not possible even after treatment with 300 mU/mL of the endo-beta-N-acetylglucosaminidases-H, F and F1
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Influencia de alterações conformacionais na atividade da fosfatase acida de sementes quiescentes de soja
Alexandre Donizeti Martins Cavagis
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