Regulação da interação IRS-1/SHP2 em modelos de resistencia a insulina
Maria Helena de Melo Lima
TESE
Português
(Broch.)
T/UNICAMP L628r
Campinas, SP : [s.n.], 2000.
109p. : il.
Orientador: Mario Jose Abdalla Saad
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: A insulina, ao se ligar à subunidade a de seu receptor heterotetramérico, dá início a uma série de ações imediatas e tardias, metabólicas e promotoras de crescimento. Tais eventos ocorrem através da estimulação da subunidade 13 transmembrana do receptor, que se autofosforila e ativa a...
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Resumo: A insulina, ao se ligar à subunidade a de seu receptor heterotetramérico, dá início a uma série de ações imediatas e tardias, metabólicas e promotoras de crescimento. Tais eventos ocorrem através da estimulação da subunidade 13 transmembrana do receptor, que se autofosforila e ativa a fosforilação de substratos endógenos intracelulares, dos quais o mais estudado é o IRS-l. Esta proteína de peso molecular _160 kDa pode ser bem caracterizada como um substrato direto do receptor de insulina e quando se fosforila associa-se a proteínas com porção SH2, PI-3 quinase e SHP2 ativando-as. Uma etapa distal a estas associações/ativações é a fosforilação em serina da AKT/PKB. Utilizando-se técnicas de "immunoblotting" com anticorpos anti-IRS-l, antifosfotirosina, anti-SHP2 e antiAKT/PKB é possível analisar o grau de fosforilação do IRS-l e AKT/PKB, a concentração protéica da SHP2 e a associação do IRS-l com SHP2, ou seja, as ações iniciais da insulina. Neste estudo investigamos a quantidade protéica da SHP2, o grau de fosforilação do IRS-l e associação com SHP2 e a fosforilação do AKT /PKB no tecido muscular e hepático de ratos normais e em cinco modelos de resistência à insulina: o jejum prolongado, o envelhecimento, o uso agudo de adrenalina, o uso crônico de dexametasona e ratos com diabetes induzido por STZ. Em experimentos com ratos normais para avaliação do efeito tempo após infusão de insulina no grau de fosforilação do IRS-l e associação com SHP2, verificou-se que o pico de fosforilação do IRS-l e associação IRS-l/SHP2 foi aos 30" para o tecido hepático e aos 90" para o tecido muscular, após a infusão de insulina, na veia porta. Nos animais que receberam estreptozotocina, em tecido hepático não houve alteração no nível protéico da SHP2. Observamos um aumento significativo no grau de fosforilação do IRS-l para 141 :!: 12%, p < 0,05, quando comparados aos animais controle. Não houve alteração na associação IRS-l/SHP2 quando comparados com o controle. Houve uma redução para 65 :!: 6%, p< 0,035, no grau de fosforilação do AKT/PKB. Em tecido muscular destes animais tratados com estreptozotocina, não houve alteração no nível protéico da SHP2, ocorrendo um aumento para 191 :!: 14%, p< 0,036 no grau de fosforilação do IRS-l quando comparados com o controle, sem alteração na associação IRS-l/SHP2 quando comparados com o controle. O grau de fosforilação do AKT IPKB foi reduzido para 70 :t 7%, p< 0,04, nos animais tratados com STZ quando comparados com o controle. Animais submetidos ao tratamento agudo de adrenalina não apresentaram alteração no nível protéico da SHP2 tanto para o tecido hepático como para o muscular. Houve uma redução significativa no grau de fosforilação do IRS-l para 37 :t 3%, (p< 0,019), e para 37 :t 7%, (p< 0,003) em tecido hepático e muscular respectivamente, acompanhado de uma diminuição da associação IRS/SHP2 para 52 :t 3%, (p< 0,002), e para 20 :t 7%, (p< 0,041), em tecido hepático e muscular, respectivamente. A fosforilação do AKTIPKB foi reduzida para 60 :t 5%, (p< 0,045), e para 70 :t 6%, (p< 0,030), em tecido hepático e muscular, respectivamente O envelhecimento não alterou o nível protéico da SHP2 em tecido hepático. A fosforilação do IRS-l foi reduzida para 64 :t 7%, (p< 0,029), ocorrendo um aumento na associação IRS-lISHP2 para 155 :t 9%, (p< 0,012) em tecido hepático dos animais senis. O grau de fosforilação do AKTIPKB dos animais senis não apresentou alteração. Em tecido muscular dos animais com 20 meses de idade observamos que não houve alteração do nível protéico da SHP2. O grau de fosforilacão do IRS-l foi reduzido para 50 :t 7%, (p<0,007), acompanhado de uma redução na associação do IRS-lISHP2 para 48 :t 12%, (p< 0,034), como também uma redução no grau de fosforilação do AKTIPKB para 70 :t 6%, (p< 0,05), em tecido muscular do animais senis quando comparados com o controle. Os animais mantidos em jejum prolongado não apresentaram alteração no nível protéico da SHP2 tanto para tecido hepático como muscular. Houve um aumento no grau de fosforilação do IRS-l para 152 :t 13%, (p< 0,007), e para 155 :t 2%, (p< 0,004), em tecido hepático e muscular, respectivamente, em relação aos animais alimentados. Observamos um aumento na associação do IRS-lISHP2 para 136 :t 7%, (p< 0,035), e para 162 :t 7%, (p< 0,019), em tecido hepático e muscular, respectivamente, quando comparados com os animais alimentados. Os animais submetidos ao tratamento crônico com dexametasona tanto para o tecido hepático como para o muscular não apresentaram alteração no nível protéico da SHP2. Houve uma redução significativa no grau de fosforilação do IRS-l para 48 :t 5%, (p< 0,040), e para 36 :t 5%, (p< 0,035), em tecido hepático e muscular, respectivamente, quando comparados com os controles. Não houve alteração na associação IRS-lISHP2 em tecido hepático e muscular do animais que receberam tratamento crônico com dexametasona quando comparados com o controle. A análise in_egrada dos 5 modelos animais sugere que a regulação do grau de fosforilação do IRS-l, bem como da interação deste com a PI 3-quinase depende dos níveis insulinêmicos do animal: animais hiperinsulinêmicos apresentam menor fosforilação e menor interação IRS-l/PI 3-quinase, e animais hipoinsulinêmicos mostram o oposto. Por outro lado, a regulação da interação IRS-lISHP2 não parece manter nenhuma relação com níveis insulinêmicos. Parece que a interação IRS-lISHP2 contribui para a modulação da transmissão do sinal insulínico, influenciando a fosforilação/ativação da AKT/PKB. Em situações com aumento da fosforilação do IRS-I sem aumento na associação IRS-l/SHP2, o efeito final do AKT/PKB é atenuado, como demonstrado em figado e músculo de animais tratados com STZ. Por outro lado, a diminuição da fosforilação do IRS1, sem uma diminuição da associação IRS-lISHP2, protege a fosforilação do AKT /PKB, como demonstrado em figado dos animais senis
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Abstract: Insulin stimulates the tyrosine kinase activity of insulin receptor resulting in the phosphorylation of its cytosolic substrate, insulin receptor substrate 1 (IRS-l). After activation on by insulin, IRS-l associates with several proteins, including phosphatidylinositol (PI) 3-Kinase,...
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Abstract: Insulin stimulates the tyrosine kinase activity of insulin receptor resulting in the phosphorylation of its cytosolic substrate, insulin receptor substrate 1 (IRS-l). After activation on by insulin, IRS-l associates with several proteins, including phosphatidylinositol (PI) 3-Kinase, phosphotyrosine phosphatase Syp, and adapter molecules like Nck, Grb2 and Fyn. U sing antipeptide antibodies to SHP2, to IRS-l, to antiphosphotyrosine and to AKT /PKB it is possible to study insulin-stimulated IRS-l phosphorylation and the association between IRS-l and SHP2; and the of phosphorylation AKT/PKB. It's also possible to quantify the leveI of SHP2. In the present study we have examined early steps of insulin action in muscle and liver in tive animal models of insulin resistance: 72 hours fasting and diabetes (STZ) (hypoinsulinemia), aging and effect of chronic treatment with dexametasone (hyperinsulinemia) and the effect of acute epinephrine treatment (normoinsulinemia). We used immunoprecipitation and immunoblotting technices with specitic antibodies. ln liver of diabetic rats (STZ) there was an increased IRS-1 phosphorylation o 141 :t 12% compared to the control value (p <0.05). The IRS-l/SHP2 association did not change, but the phosphorylation leveI of AKT/PKB was decreased in the liver of rats treated with STZ. In muscle samples there was an increase in IRS-l phosphorylation to 191:t 14% (p< 0.036), without change in the association ofIRS-l with SHP2. There was also no change in SHP2 protein levei, and the AKT/PKB phosphorylation was reduced to 70:t 7%(p< 0.04) of in muscle of diabetic rats compared to contrais. In fasting there was an increase to 152 :t 13% (p< 0.007) in IRS-l phosphorylation. There was also an increase of IRS-lISHP2 association to 136 :t 7% (p< 0.035) in liver tissue of fasting rats, after insulin stimulation compared to contraIs. In muscle samples from fasting rats the results were similar to that in liver. There was an increase to 155 :t 2% (p<0.019) IRS-l in phosphorylation in tissue of diabetic rats compared to contrais after insulin-stimulation. There was an increase of IRS-lISHP2 association of 162:t 7% (p< 0.019) in tissue of diabetic rats compared to contrais. In rats treated acutely with epinephrine there was a decrease in insulin stimulated IRS-1 phosphorylation to 37 :t 3% of control value (p< 0.019), accompained by reduced to 52 :t 3% (p< 0.002) in IRS-l/SHP2 association in liver. The leveI of SHP2 protein was found be unchanged and the AKT!PKB phosphorylation induced by insulin was reduced to 60 :t 5% (p< 0.045) in the liver of rats treated acutely with epinephrine. In muscle of epinephrine treated rats, there was a marked reduction to 57 :t 9% (p< 0.003) in insulin-stimulated IRS-1 phosphorylation compared to controI. The association of IRS-l/SHP2 was reduced to 20 :t 7% (p< 0.041) in muscle of epinephrine treated rats. There was no change in the SHP2 protein leveI, and the phosphorylation of AKT!PKB was reduced to 70:t 6% (p<0.030) in muscle ofrats treated with epinephrine. There was a decrease in IRS-1 phosphorylation to 64 :t 7% in liver of 20-month-old rats compared to 2-month-old rats. When the same blots were subsequently incubated with anti-SHP2 antibody there was an increase to 155 :t 9% (p<0.012) in insulin-induced IRS-l/SHP2 association in liver of 20-month-old rats compared to 2-months-old rats. Aging did not change the leveI of SHP2 protein and the phosphorylation leveI of AKT!PKB in liver. In muscle there was a decrease in insulin-stimulated IRS-1 phosphorylation to 50 :t 7% (p< 0.007) in 20-months-old rats. There was a simultaneous decrease to 48 :t 6% (p< 0.034) in insulin-induced IRS-l/SHP2 association in muscle of 20-months-old rats. The AKT!PKB phosphorylation was reduced to 70 :t 6% (p< 0.05) in muscle of the 20-month-old rats when compared 2-month-old rats. Finaly, dexamethasone treatment for 5 days induced a decrease in insulin-stimulated IRS-1 phosphorylation levels to 48:t 5% (p< 0.040), without changes in insulin-induced IRS-l/SHP2 association in liver of rats. Immunoprecipitation and immunoblotting with anti-SHP2 antibody showed that the leveI of this protein did not change in liver of rats treated with dexamethasone. In muscle tissue the results were similar to that in liver. There was a reduced in insulin-induced IRS-1 phosphorylation to 36 :t 5% (p< 0.035), and there was no change in the association of IRS-1 with SHP2 in muscle of rats treated with dexametasone afier stimulation with insulin. There was also no change in SHP2 protein leveI in muscle oftreated rats compared to controls. In summary, the results demonstrated that in hiperinsulinemia animaIs (i.e.; aging and dexamethasone treatment) there is a increased IRS-I phosphorylation induced by insulin compared to controls and in hipoinsulinemia models (i.e.; fasting and STZ treatment) the IRS-l phosphorylation induced by insulin is reduced. This phenomenon influence the downstream signal transduction through the IRS-l pathway as indicated by reduced insulin-induced AKT/PKB phosphorylation in liver and muscle of diabetic rats; increased insulin-induced IRS-l/SHP2 association in liver and muscle of fasting rats and liver of aging animaIs. Our results suggest that modulation in insulin signal transduction through IRS-I may occur in response to insulin circulatory levels and for metabolic changes
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Saad, Mario José Abdalla, 1956-
Orientador
Brenelli, Sigisfredo Luis, 1954-
Avaliador
Carvalho, Carla Roberta de Oliveira
Avaliador
Boschero, Antonio Carlos, 1943-
Avaliador
Carneiro, Everardo Magalhães, 1955-
Avaliador
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Maria Helena de Melo Lima
Regulação da interação IRS-1/SHP2 em modelos de resistencia a insulina
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