Resumo: A aprotinina é um inibidor de serino-proteases presente em órgãos bovinos, utilizado como composto farmacêutico em operações cirúrgicas e em cultura de células. Atualmente a aprotinina não é comercialmente produzida no Brasil. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um processo de recuperação de aprotinina a partir de efluente industrial da produção de insulina bovina (SPI), centrado em cromatografia por quimotripsina imobilizada. Foram estudadas três estratégias: a) cromatografia em quimotripsina imobilizada; b) cromatografia em hidroxiapatita seguida de cromatografia em quimotripsina imobilizada e c) cromatografia em quimotripsina imobilizada seguida de cromatografia de afinidade por íon metálico imobilizado (IMAC) utilizando cobre como ligante. A eficiência do processo foi analisada através ensaios de inibição de tripsina e quimotripsina, "dot blot" e eletroforese das frações cromatográficas. A primeira estratégia resultou na recuperação e purificação de aprotinina, da coluna em quimotripsina imobilizada, principalmente nos valores de pH 4,0 e 3,0, quando realizada dessorção em degrau de pH. Na segunda estratégia inicialmente estudou-se o efeito da influência do pH e concentração de NaCI na adsorção de aprotinina de alta pureza na hidroxiapatita. Um planejamento estatístico experimental indicou como condição de alta eficiência tampão fosfato 1 mM, pH 6,5 e 18 mM de NaCI. Dentre 11 soluções estudadas, cloreto de cálcio 3 mM foi a que apresentou melhores índices de dessorção. Entretanto esta segunda estratégia não foi eficiente quando o SPI foi aplicado ao processamento, provavelmente devido a baixa especificidade da hidroxiapatita frente a aprotinina no meio. A terceira estratégia foi a melhor opção estudada para a recuperação e purificação da aprotinina. IMAC foi eficiente como etapa final da purificação depois da recuperação em quimotripsina imobilizada: fatores de purificação global foram tão altos quanto 952 Ver menos

Abstract: Aprotinin is a pharmaceutical compound used in surgeries and tissue cultures, currently not commercially produced in Brazil. It is a serine-protease inhibitor present in bovine organs. The objective of this work was to develop a process for the recovery of aprotinin from industrial effluent of bovine insulin production (SPI), based on affinity chromatography onto immobilized chymotrypsin. Three approaches were used: a) chromatography onto immobilized chymotrypsin; b) chromatography onto hydroxyapatite followed by chromatography onto immobilized chymotrypsin; and c) chromatography on immobilized chymotrypsin followed by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) with cupper as the ligant. Efficiency was analysed based on trypsin and chymotrypsin inhibitions, dot blotting, and electrophoresis assays of the chromatographic fractions. The first approach resulted in aprotinin recovery and purification from the chymotrypsin column with pH step elution gradient, mainly at pH 4.0 and 3.0. The second approach was initiated by studying the effects of phosphate buffer solution pH and NaCI concentration on high purity aprotinin adsorption from buffer solutions onto hydroxyapatite. This study was carried out according to a factorial experimental design and indicated 18 mM NaCI and a pH of 6.5 as a high efficiency adsorption condition. Among 11 solutions tested, 3 mM calcium chloride was selected as the best eluent. However, this second approach was not efficient when applied to the processing of SPI probably due to the low specificity of hydroxyapatite towards aprotinin in this medium. The third approach was the best option studied for aprotinin recovery and purification. IMAC was efficient in further purifying aprotinin after its recovery and purification with the chymotrypsin chromatography: overall purification factors were as high as 952 Ver menos