Efeito das condições de cultivo primario sobre as celulas NK uterinas (NKU) e avaliação da sua viabilidade in vitro
Priscila Meirelles Fonseca
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP F733e
Campinas, SP : [s.n.], 2000.
101f. : il.
Orientação: Aureo Tatsumi Yamada
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: As células natural killer uterinas (NKu) estão presentes no útero de roedores durante a gestação, período em que surgem e se diferenciam, desaparecendo por completo ao final deste. Os fatores envolvidos nos mecanismos de diferenciação e ativação destas células, bem como as funções por estas...
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Resumo: As células natural killer uterinas (NKu) estão presentes no útero de roedores durante a gestação, período em que surgem e se diferenciam, desaparecendo por completo ao final deste. Os fatores envolvidos nos mecanismos de diferenciação e ativação destas células, bem como as funções por estas desempenhadas são pouco conhecidas. A dificuldade na compreensão plena das funções das NK do ambiente uterino é atribuída à complexidade e dinamismo do ambiente uterino durante a gestação. Os estudos realizados in vitro são igualmente inconclusivos devido à falta do estabelecimento de uma condição padrão nos ensaios realizados. O presente trabalho teve o intuito de padronizar uma condição de obtenção e manutenção de células NKu viáveis para ensaios in vitro, a partir do cultivo primário da glândula metrial. Foram utilizados fragmentos (explantes) da glândula metrial obtidos de camundongos prenhes no 8° dia de gestação (ddg). Estes explantes foram cultivados por 24 e 48 horas, em meios de cultivo MEM e RPMI, com ou sem a adição de MCE (meio condicionado esplênico). Os explantes em O hora (controle) e após 24 ou 48 horas de cultivo, assim como as células derivadas destes explantes (aderidas e em suspensão) no cultivo, foram processados para as análises histoquímicas de PAS e lectina DBA (Dolichos biflorus aglutinin) e para análises ultra-estruturais em MET. Os resultados demonstraram que tanto as formas aderidas quanto em suspensão apresentaram positividade à reação histoquímica de PAS e lectina DBA, sendo identificadas como sendo células NKu. O explante residual mostrou sinais de degeneração acentuada após 24 horas, independentemente das condições de cultivo empregadas. Pela MET, o maior índice de células NKu com boa preservação ultra-estrutural foi observada nas células NKu aderidas obtidas após 24 horas de cultivo em meio RPMI padrão, sem suplementação do meio condicionado esplênico (MCE). Estas condições de cultivo foram estabeleci das como padrão para a obtenção de células NKu morfologicamente bem preservadas, sendo utilizadas nos ensaios ín vítro, para avaliar a viabilidade destas células. Sob o efeito da lectina DBA, as células NKu demonstraram variações nos padrões morfológicos e de marcação pela lectina DBA, dependentes da concentração e tempo de ação, constatadas pelas microscopias de tluorescência e eletrônica de varredura (M EV). Pelos resultados obtidos, estabeleceram-se as condições de cultivo para obtenção de células NKu preservadas a partir do cultivo de explantes da glândula metrial, sendo estas células passíveis de serem utilizadas em ensaios in vítro. Pelo padrão de resposta das células NKu em conseqüência da ação da lectina DBA utilizada para avaliar a viabilidade destas células ín vítro, sugere-se que o substrato presente na superfície das células NKu poderia ser um potencial receptor de membrana envolvido no mecanismo de resposta celular
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Abstract: During the pregnancy, uterine natural killer (uNK) cells appear in the rodent uterus, differentiate and disappear at the end of this period. H oweve r, which factors are involved in the differentiation[activation mechanisms of uNK cells, as well as in their functions, remain to be solved....
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Abstract: During the pregnancy, uterine natural killer (uNK) cells appear in the rodent uterus, differentiate and disappear at the end of this period. H oweve r, which factors are involved in the differentiation[activation mechanisms of uNK cells, as well as in their functions, remain to be solved. The advancing on knowledge about these cells has been due to the complexity and dynamism of the uterine environment during pregnancy. Even the in vitro studies are inconclusive since no standard condition has been established. The present work proposed to establish a standard condition of culture to obtain and maintain uNK cells and further evaluate their viability for in vitro assays. Metrial gland fragments (explants) were obtained from the uterus of mice on 8th days of pregnancy and used as explants of culture The explants were cultured during 24 and 48 hours, in MEM and RPMI media, added or not with spleen-conditioned medi um (SCM). The O hour explants and after 24 or 48 hours of incubation, as well as explants derived cells (adherents and notadherents), were processed for PAS and DBA (Dolichos biflorus agglutinin) histochemistry analyses and for ultrastructural analyses in TEM. The results showed positive reaction to PAS and DBA histochemistries both for adherent and not-adherent cell forms in the culture. The residual explant showed degenerative signals after 24 hours, in despite of the culture conditions. The highest index of well-preserved uNK cells evaluated at ultrastructural levei was found to adherent uNK form, after 24 hours in standard RPMI, without the supplementation with SCM. This procedure was established as standard culture conditions to obtain morphologically well preserved uNK cell that was used to in vitro assays for evaluation of cellular viability. Under the effect of DBA lectin, uNK cells showed changes in morphology and labelling patterns, upon dependence of concentration and time lapsed effect, as noticed by fluorescence and scanning electron microscopes (SEM). Altogether, our findings allowed to establish the conditions to obtain wel
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preserved uNK cel
from the explants of metrial gland in culture, which are useful for in vitro assays. Based on in vitro assay with DBA lectin, it is proposed that the DBA lectin reactive substrate localised on uNK cell surface could be a potential membrane receptor related in the mechanism of cellular responsiveness
Efeito das condições de cultivo primario sobre as celulas NK uterinas (NKU) e avaliação da sua viabilidade in vitro
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