Purificação de imunoglobulina G a partir do plasma ou soro humano utilizando cromatografia de afinidade com ions metalicos imobilizados
Sandra Vançan
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP V277p
Campinas, SP : [s.n.], 1999.
81p. : il.
Orientador: Sonia Maria Alves Bueno
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Resumo: Atualmente, a purificação de proteínas do plasma utilizando métodos seletivos (cromatográficos) tem sido visto pela indústria farmacêutica como uma operação necessária, uma vez que proteínas altamente purificadas limitam os riscos de efeitos colaterais em pacientes. Por isso, o...
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Resumo: Atualmente, a purificação de proteínas do plasma utilizando métodos seletivos (cromatográficos) tem sido visto pela indústria farmacêutica como uma operação necessária, uma vez que proteínas altamente purificadas limitam os riscos de efeitos colaterais em pacientes. Por isso, o desenvolvimento de métodos seletivos de purificação em larga escala são hoje indispensáveis para aumentar a diversidade, melhorar o rendimento e o grau de pureza das proteínas terapêuticas extraídas do plasma. No presente trabalho estuda-se a viabilidade de separar imunoglobulina G (IgG) a partir do plasma humano utilizando cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados, IMAC. Esta técnica explora a afinidade de proteínas por íons metálicos imobilizados e tem sido utilizada para purificar várias proteínas e peptídeos. Experimentos cromatográficos foram realizados com IgG humana pura para selecionar o íon metálico entre Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2+, a ser imobilizado no agente quelante (IDA) e vários tampões foram testados na etapa de adsorção. As proteínas adsorvidas no suporte foram eluídas pela protonação dos grupos doadores de elétrons da proteína reduzindo-se o pH do meio ou por competição com outra espécie doadora de elétrons (gradiente crescente da concentração de imidazol). Estes íons metálicos imobilizados no agente quelante EDA apresentaram diferentes forças de retenção da proteína (IgG humana pura). Selecionado o íon metálico Ni2+, a seletividade do suporte em adsorver IgG foi determinada empregando plasma humano de indivíduos sadios. Como IgG não foi purificada em IDA-Ni2" a níveis expressivos, utilizou-se uma segunda coluna em série com a primeira, a fim de obter maior pureza de IgG. Análises nefelométricas da fiação retida em colunas IDA-Zn em série com IDA-Ni2" e eluída a pH 5,0 mostraram a presença de 41,90% de IgG, 1,34% de IgM, 2,10% de IgA e 54,69% de transferrina. As proteínas contaminantes, transferrina e IgM, podem ser removidas da amostra por cromatografia de filtração em gel. A análise realizada por focalização isoelétrica das frações de lavagem e de eluição dos experimentos conduzidos com IgG humana Sigma, mostrou que a distribuição de pontos isoelétricos nas frações de lavagem e eluição não dependeu do íon metálico imobilizado (dentre os estudados), nem do sistema tamponante utilizado. Observou-se que as frações não retidas (lavagem) apresentaram IgG de baixo pi (entre 5,0 e 6,0). Não obteve-se seletividade na eluição de IgG por decréscimo de pH (íons Ni2^ imobilizado) ou incrementos na concentração de imidazol (íons Ni2+ e Zn2+ imobilizados), todas as frações apresentaram pi de 6,0 a 8,65, não sendo observado a separação
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Abstract: Purification of plasma proteins through selective methods, such as cromatography, has been recognised in nowadays as an important operation by pharmaceutical industry as the highly purified proteins reduce side effects. Therefore, the development of purificaton selective methods for large...
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Abstract: Purification of plasma proteins through selective methods, such as cromatography, has been recognised in nowadays as an important operation by pharmaceutical industry as the highly purified proteins reduce side effects. Therefore, the development of purificaton selective methods for large scale operations are extremely important to broad diversity, improve the yield and purity of therapeutic proteins extracted from plasma. In this work a flexibility study on the separation of immunoglobulin G (IgG) from human plasma through immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) is carried out. This technique exploit the protein affinity for immobilized metal ion and has been used to purity several proteins and peptides. Chromatography were carried out with pure human IgG in order to select the metal ion amongst Cu2+, Ni2+, Zn2+ e Co2", to be immobilized on IDA. Several buffers were tested in the adsorption stage as well. The proteins adsorbed on the support were eluted by the protonation of the electron-donating species on the protein using a decreasing pH step gradient or increasing imidazole concentration. The metal ion bonding chelating agents (IDA) showed distinct interactions with protein (pure human IgG). Since Ni2+ was selected, the support selectivity to adsorb IgG was determined with human plasma from healthy people. As IgG has not been completely purified on IDA-Ni2^, a second column (containing immobilized Ni2") has been used in series with the first one (containing immobilized Zn2") in order to achieve a ligher purity degree of IgG. Nephelometric analysis of the retained fraction on ID A-Zn2" columns in series with IDA-Ni2+, and eluted at pH 5.0 determinated 41.90% of IgG, 1.34% of IgM, 2.10% of IgA and 54.69% of transferrin. The contaminant proteins (transferrin and IgM) could be removed using gel filtration. The analysis carried out by isoelectric focusing of wash e elution fractions using human IgG (Sigma), showed that the isoelectric point distribution in the wash and elution fractions were not dependent neither on the immobilized metal ion or the buffer used. It could be observed that the non-retained fractions (wash) contained IgG with low pi (between 5.0 e 6.0). Selectivity in IgG elution by decreasing pH step gradient (immobilized Ni2+) or increasing imidazole concentration (immobilized Ni2r and Zn2+) was not reached, all retained fractions contained IgG with pi between 6.0 and 8.65, and separation was not observed
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