Estudos de difração de raios-x a alta resolução da beta-lactoglobulina bovina
Kesley Moraes Godinho de Oliveira
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP OL4e
Campinas, SP : [s.n.], 1999.
80 p. : il.
Orientador: Igor Polikarpov
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin
Resumo: A beta-lactoglubulina (BLG) pertence à família das lipocalinas e é encontrada em um grande número de mamíferos. Desde sua primeira purificação tem sido exaustivamente estudada. Em condições fisiológicas, a BLG existe como dímero onde cada monômero possui 162 aminoácidos correspondendo a...
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Resumo: A beta-lactoglubulina (BLG) pertence à família das lipocalinas e é encontrada em um grande número de mamíferos. Desde sua primeira purificação tem sido exaustivamente estudada. Em condições fisiológicas, a BLG existe como dímero onde cada monômero possui 162 aminoácidos correspondendo a aproximadamente 18kDa. Embora as propriedades físico-quimicas da BLG sejam notórias, sua função biológica permanece desconhecida. A BLG sofre mudanças conformacionais próximo ao pH 7,5 constatadas através de experimentos de rotação óptica específica e de curvas de titulação. Esta transição, denominada transição de Tanford, definiu o primeiro objetivo deste trabalho: resolver estruturas cristalográficas da BLG na faixa de pH ácido e básico a fim de investigar as modificações estruturais ocasionadas por esta transição. O leite de vaca possui variantes genéticas sendo que as variante A eB são predominantes. A isoforma A difere na sequência primária em relação a isoforma B nas posições 64 (Asp=>Gly) e 118 (Val=>Ala). Estas diferenças resultam em propriedades fisico-químicas diferentes destas variantes e afetam o processamento do leite e derivados. O segundo objetivo deste trabalho foi a resolução das estruturas cristalográficas destas variantes a fim de explorar possíeis variações de origem estrutural, que viessem a justificar as diferenças fisico-quimicas entre ambas. Cristais de beta-lactoglubulina foram crescidos na faixa de pH ácido e básico. Em pH ácido, o cristal foi obtido a partir da mistura de isoformas A/B, variante A e variante B. os cristais foram expostos a raios-X e os padrões de difração coletados. As estruturas cristalográficas da beta-lactoglobulina foram determinadas por sustituição molecular e as coordenadas dos modelos de fases obtidos foram submetidas a refinamento. A mistura de isoformas A/B (P1), em pH ácido, foi determinada a 1,6 Â e refinada até um fator R cristalográfico de 19.8 % (Rfree = 25,0% e 171 moléculas de água). A correspondente em pH básico foi determinada a 2,0. Â e refinada até um fator R cristalográfico de 19,4% (Rfree = 27,2% e 135 moléculas de água). As estruturas das variantes A eB foram determinadas a 2,0 Â e 1,95 Â e refinadas até um fator R cristalográfico de 19,2% (Rfree = 28,7% e 123 moléculas de água) e 18,9% (Rfree = 25,2% e 107 moléculas de água) respectivamente. A comparação entre as estruturas resolvidas em diferentes valores de pH possibilitou a visualização do efeito da transição de Tanford,; duas alças da estrutura representadas pelos resíduos 84 a 90 e 123 a 131 sofrem uma abertura e tornam expostos os grupos carboxil dos resíduos Glu 89 e Asp 129. Estes resíduos seriam, então, os responsáveis pelo comportamento anômalo observado para aBLG em torno do pH 7,5. A superposição entre as estruturas das variantes A eB revelou que os resíduos 108 a 117 adotam uma conformação diferente nas variantes. Outro aspecto encontrado foi a formação de uma cavidade no interior da proteína no resíduo 118. Nesta posição ocorre a troca de um resíduo de Val por Ala nestas variantes. Esta cavidade pode estar associada com a estabilidade destas variante
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Abstract: Beta-lactoglobulin (BLG), a very abundant protein found in several species of mammals belongs to the lipocalin family. Under physiological conditions, BLG is a dimmer of 162 aminoacids per monomer, with a molecular mass of approximately 18kDa in each subunit. Although BLG has important...
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Abstract: Beta-lactoglobulin (BLG), a very abundant protein found in several species of mammals belongs to the lipocalin family. Under physiological conditions, BLG is a dimmer of 162 aminoacids per monomer, with a molecular mass of approximately 18kDa in each subunit. Although BLG has important physicochemical properties, its biological function remains unclear. BLG undergoes a number of conformational changes near pH 7,5 as indicated by specific optical rotation and titration curve. This transition, termed Tanford transition, defined the first goal of this work: to solve crystallographic structures of BLG near acidic transition. Bovine milk has many genetic variants of BLG, but the most prevalents are variants A and B. Variant A differs in the amino acid sequence at positions 64 (Asp® Gly) and 118 (Val® Ala) from variant B. These aminoacid changes cause differences in physicochemical properties of these variants and influence milk processing and milk derivatives. The second goal of this work was to solve the crystallographic structures of variants A and B with the purpose of exploring possible variants of structural origin, which could justify the physicochemical differences between both of them. Cystals of beta-lactoblobulin were grown under acidic and basic pH. Under acidic pH, the crystal was obtained from a mixture of isoforms A and B, and belongs to space group P1. Under basic pH, the crystals belong to space group C2221 and were grown from the mixture A/B, variant A and variant B. Crystals were exposed to X-rays and diffraction data were obtained. The crystal structures of beta-lactoglobulin were solved by the molecular replacement method and the initial model obtained was refined. The mixture of isoforms A/B (P1), under acidic pH, was determined at 1,6 Å resolution and refined to a crystallographic R factor of 19,8% (Rfree=25,0%) with 171 solvent molecules. The corresponding structure in basic pH was determined at 2,0 Å resolution and refined to a crystallographic R factor of 19,4% (Rfree=27,2%) with 135 solvent molecules. The crystal structures of variants A and B were determined at 2,0 Å e 1,95 Å resolution and refined to an crystallographic R factor of 19,2% (Rfree=28,7% and 123 solvent molecules) and 18,9% (Rfree=25,2% and 107 solvent molecules) respectively. The comparison between structures solved under different pHs allowed the visualization of the effect caused by Tanford transition: two loops of the structure formed by residues 84 to 90 and 123 to 131 open up and expose the carbonyl groups of residues Glu 89 and Asp 129. These two residues are considered responsible for the anomalous behavior observed to BLG when it is in pH 7,5. The superposition of the structure in the variants A and B revealed that residues 108 to 117 adopt a different conformation in the variants. Another aspect that was observed is the creation of an internal cleft close to residue 118, due to the change of one Valine by an Alanine. This cleft may be related to the stability of these variants
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Estudos de difração de raios-x a alta resolução da beta-lactoglobulina bovina
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