Identificação da enzima oxido nitrico sintase em vegetais
Euripedes de Almeida Ribeiro Junior
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP R354i
Campinas, SP : [s.n.], 1999.
68f. : il.
Orientador: Ione Salgado Martins
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo:A enzima óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese de óxido nítrico (NO) através da oxidação da L-arginina a L-citrulina. Esta enzima é encontrada amplamente distribuída na natureza. No reino animal, as isoformas de NOS constitutivamente expressas são freqüentemente Ca2+...
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Resumo:A enzima óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese de óxido nítrico (NO) através da oxidação da L-arginina a L-citrulina. Esta enzima é encontrada amplamente distribuída na natureza. No reino animal, as isoformas de NOS constitutivamente expressas são freqüentemente Ca2+ -dependentes e envolvidas em processos fisiológicos enquanto que isoformas de NOS Ca2+-independentes são normalmente induzidas a produzir grandes quantidades de NO em situações patológicas. Evidências da existência de uma via endógena para a síntese de NO no reino vegetal tem surgido nos anos recentes. No presente trabalho investigou-se a presença da NOS em algumas espécies vegetais, avaliando-se a reação cruzada de anticorpos produzidos contra NOS de macrófagos de camundongos e de cérebro de rato com extratos de diferentes tecidos vegetais, e também medindo-se a atividade NOS pela produção de L-[U-14C]-citrulina a partir de L-[U-14C]-arginina. Anticorpos contra NOS de macrófagos e NOS de cérebro detectaram uma proteína de aproximadamente166 kDa em ensaios de Western blot com extratos citossólicos de ápices radiculares e folhas jovens de plântulas de milho. A imunolocalização, usando anticorpos contra NOS de macrófagos conjugados com isotiocianato de fIuoresceína, revelou esta proteína no citosol das células na zona de divisão bem como no núcleo das células da zona de elongação de ápices radiculares de milho. Os extratos citossólicos de ápices radiculares e folhas jovens de milho apresentaram atividade NOS Ca2+ -dependente, medida pela sensibilidade aos inibidores da NOS, como L-NAME, L-NMMA, L-NNA e aminoguanidina. Estes resultados sugerem a existência de uma enzima NOS constitutiva nestes tecidos de milho e que a localização subcelular desta proteína depende da fase de crescimento celular. Extratos citossólicos derivados de cultura de células de laranja também apresentaram reação cruzada com anticorpos produzidos contra NOS de macrófagos e cérebro. Os extratos citossólicos derivados da região dos pêlos absorventes de raízes de milho apresentaram atividade NOS muito maior, comparada com os ápices radiculares e as folhas jovens. Esta atividade se mostrou Ca2+ -independente, sugerindo a existência de uma isoforma induzida nesta zona da raiz. Uma atividade NOS Ca2+ -independente também foi detectada em células mãe de grãos-de-pólen de café em diferentes estágios de divisão meiótica sugerindo um papel para esta enzima no processo de microsporogênese de café. O conjunto de resultados indica a existência, em vegetais, de diferentes isoformas de uma enzima do tipo NOS que pode ter um importante papel no controle do crescimento e na diferenciação celular
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Abstract: The enzyme nitric oxide synthase (NOS) is responsible for the synthesis of nitric oxide (NO), from the oxidation of L-arginine to L-citrulline. This enzyme has been found largely distributed in nature. In the animal kingdom, the NOS isoforms constitutively expressed are frequently Ca2+...
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Abstract: The enzyme nitric oxide synthase (NOS) is responsible for the synthesis of nitric oxide (NO), from the oxidation of L-arginine to L-citrulline. This enzyme has been found largely distributed in nature. In the animal kingdom, the NOS isoforms constitutively expressed are frequently Ca2+ -dependent and involved in physiological processes while Ca2+ -independent NOS isoforms are normally induced to produce large amounts of NO under pathological situations. Evidences for the existence of an endogenous pathway for NO synthesis in the plant kingdom has emerged in recent years. In the present work we investigate the presence of NOS in some plant species, by checking the ability of antibodies raised against mouse macrophage NOS and rabbit brain NOS cross-react with Iysates prepared from different plant tissues and also measured NOS activity, by L- [U_14C]-citrulline production from L-[U-14C]-arginine. Antibodies against macrophage NOS and brain NOS detected a protein of about 166 kDa in Western blot assays of cytosolic fractions of root tips and young leaves of maize seedlings. Immunochemical localization, using antibodies against macrophage NOS, conjugated with fluorescein isothiocyanate, revealed this protein in the cytosol of the cells at division zone as well as in the nucleus of the cells at the elongation zone of maize root tips. Cytosolic fractions of maize root tips and young leaves presented a2+-dependent NOS activity, as measured by the sensitivity to NOS inhibitors, such as, L NAME, L-NMMA, L-NNA and aminoguanidine. These results suggest the existence of a constitutive NOS enzyme in these maize tissues with the subcellular localization of this protein depending on the phase of 0011 growth. Cytosolic fraction derived from orange cells in culture also presented cross-immunoreactivity with antibodies raised against macrophage and brain NOS. Cytosolic fraction derived from the maize root hair zone presented a much higher NOS activity compared to root tips and young leaves and this activity was shown to be Ca2+ -independent, suggesting the existence of an inducible isoform in this root zone. A Ca2+ -independent NOS activity was also detected in coffee pollen mother cells in different stages of meiotic division suggesting a role for this enzyme in the process of microsporogenesis of coffee. The overall results indicate the existence, in plants, of different NOS-like enzyme isoforms, that may have important role in the control of cell growth and differentiation
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