Ação da vitamina D3 na linhagem epitelial mamaria HC11 ras transfectada com receptor de vitamina D
Simone Maistro
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP M287a
Campinas, SP : [s.n.], 1999.
94 f. : il.
Orientador: Miriam Hatsue Honda Federico
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A 1,25-dihidroxivitamina D3, o metabólito ativo da vitamina D3, parece influir não só na homeostase do cálcio, mas também em vários processos celulares tais como, o controle da proliferação e diferenciação celulares. Sua ação na transcrição gênica ocorre através de interação com um receptor...
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Resumo: A 1,25-dihidroxivitamina D3, o metabólito ativo da vitamina D3, parece influir não só na homeostase do cálcio, mas também em vários processos celulares tais como, o controle da proliferação e diferenciação celulares. Sua ação na transcrição gênica ocorre através de interação com um receptor específico nuclear, o Receptor de Vitamina D (VDR). VDR está presente na maioria das linhagens de carcinoma mamário e em 80% dos cânceres de mama humanos. Comparando células HC11, derivada da glândula mamária normal de camundongo, com a linhagem HC11 transformada com alelo ativado de Ha-ras (HCll-ras), Escaleira e Brentani (1999) já haviam demonstrado inibição de crescimento induzido pelo tratamento com vitamina D na linhagem HCll, mas não na HC1 \-ras. Como a HC11 apresenta alto conteúdo de VDR ao contrário da HC11 -ras, interrogamos se essa seria a causa da falha da HC1 \-ras em responder a vitamina D. Para responder a essa pergunta, inicialmente, amplificamos por PCR a região do cDNA codificadora para VDR, a partir do RNA total da HC11 e iniciadores específicos. Com esse cDNA de VDR inserido no vetor de expressão pOP13 geramos 16 clones de HCll- ras transfectados com VDR, apresentando variado conteúdo de VDR. Desses clones, o clone I caracterizou-se como apresentando alta expressão de VDR, tanto por aumento do seu RNA mensageiro medido por ensaio de Northern como por aumento da proteína de VDR, determinada pelo uso de anticorpo monoclonal anti-VDR e analisada por citometria de fluxo (64,9% + 8,2% de positividade); os outros clones apresentaram expressão semelhante à HCII- ras (HC1 \-ras = 35,93% ± 15,10%; clone 7= 29,28% ± 10,62%; clone 13= 31,11% ± 27.2%), sendo a expressão da linhagem HC11= 85,5% ± 14%. O clone 1 respondeu com inibição de proliferação, como demonstrado pelo aumento do tempo de duplicação da população, medido pela contagem de células em cultura expostas a ação da Vitamina D 10 nM durante 3 dias (controle 17,28h ± l,98h vs. VD: 28,48h + 7,02h; p- 0,056) quando comparado a HCll-ra* (controle: 18,24h vs VD: 19,92h), Além disso, observamos um acúmulo de células na fase GO/Gl do ciclo celular, após o tratamento com vitamina D (controle: 79,54% ± 1,30% vs VD: 91.01% ± 2,66%, p < 0,005), como demonstrado pelo método de quantificação de conteúdo de DNA pela incorporação de Iodeto de Propídio e analise por citometria de fluxo. Note-se que esses parâmetros foram semelhantes a aqueles apresentados pela linhagem HC11 parental na presença de Vitamina D (controle: 55,9% vs VD: 82,0%). Os clones 7 e 13 com baixo conteúdo de VDR, apresentaram comportamento proliferativo semelhante ao da HC 11-ras. Nossos dados sugerem que, no modelo de progressão tumoral proporcionado pela linhagem HC11 e HC11-ras, o escape do controle de VDR determine uma vantagem proliferativa para a linhagem HCll-ras. O aumento de VDR, por si, restaurou no clone 1, um comportamento mais próximo da normalidade, o que leva a supor que os controles de proliferação normal sejam possíveis de serem recuperados em cânceres já estabelecidos. Uma diminuição de VDR em carcinoma mamário humano tem sido correlacionado com pior sobrevida sugerindo que as manipulações das vias de controle de VDR possam beneficiar estes pacientes
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Abstract: tamin D3, through its active metabolite la,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25- (OH)2 D3), is a powerful regulator of calcium homeostasis and is involved in the regulation of cell growth and differentiation in a large variety of cells. Its action is mediated primarily through binding to a member...
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Abstract: tamin D3, through its active metabolite la,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25- (OH)2 D3), is a powerful regulator of calcium homeostasis and is involved in the regulation of cell growth and differentiation in a large variety of cells. Its action is mediated primarily through binding to a member of the nuclear hormone receptor superfamily, the vitamin D receptor (VDR). Most breast cancer cells lines express VDR and breast carcinoma patients presenting with VDR positive tumors appear to be associated with longer disease free survival as compared to patients with negative tumours HC-11 cells, a mammary epithelial lineage established from midpregnant BALB/c mice, but not HC11 transformed with Haras showed a strong growth inhibition with higher percentage of cells arrested in G0/G1 phase of cell cycle when exposed to vitamin D3. In this work we asked whether the low VDR content would be the underlying cause of the lack of response of the HCll-ras cells to Vitamin D treatment. In order to study the effect of VDR overexpression in HC 11 -ras cell growth, we first obtained the mouse VDR cDNA using total HC11 RNA as the template for PCR. Using this VDR cDNA cloned into the Not-1 site of the pOP13 expression vetor, we generated 16 VDR-transfected HCll-ras clones expressing variable amount of VDR. Clone 1 presented with high VDR mRNA content, as determined by Northern blotting and high VDR protein, as measured by using biotilated anti-VDR MoAb and flow cytometry (64% ± 8,2% VDR positive cells). Clones 7 and 13 presented VDR content similar to HCll-ras (HCll-ras = 35,93% ± 15,10%; clone 7= 29,28% ± 10,62%; clone 13= 31,11% ± 27.2%) and lower than HC11 (85,5% ± 14% VDR positive cells). Clone 1 was growth inhibited, when treated with Vitamin D 10 nM during 72 hours, as showed by Cell Doubling Time (CT: 17,28h ± l,98h vs. VD: 28,48h ± 7,02h, p = 0,056) when compared to HCll-ras (CT: 18,24h vs VD: 19,92h). In addition, clone 1 increased G0/G1 phase fraction, determined by flow cytometry, when exposed to Vitamin D (CT: 79,54% ± 1,3 vs VD: 91.01% ± 2,66; p < 0,005). In keeping with these data, Clones 7 and 13 presenting with lower VDR content, were not growth inhibited as expected . Our data suggest that, in HC11 tumor progression model, the lack of susceptibility of HCll-ras to growth inhibition induced by Vitamin D treatment might be reputed to its low VDR content. Furthermore, the effect of VDR replacemente in clone 1, restoring HC11 susceptibility to Vitamin D treatment, suggests VDR might be a possible therapeutic target in breast cancer
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