Caracterização cinetica da fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa do rim de carneiro. Estudo de inibidores
Thelma Lopes da Silva
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP Si38c
Campinas, SP : [s.n.], 1999.
68f. : il.
Orientador: Eulazio Mikio Taga
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: A proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (20 kDa) do rim de carneiro foi purificada 1.291 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 4%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia de troca-iônica em SP-Sephadex com...
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Resumo: A proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (20 kDa) do rim de carneiro foi purificada 1.291 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 4%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, cromatografia de troca-iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular (Sephacryl S-200). A enzima 1 ¿1 purificada apresentou uma A.E. de 99,4 µmol min mg . O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou uma faixa de pH ótimo de 4,0 a 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 57°C. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos, reagentes redutores de tióis e íons metálicos, exceto pela inibição por Zn2+, CU2+, Hg2+ e Ag+ e, pela ativação por guanosina. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 54,5 kJ mol-1 K-1. Dos substratos testados, o pNPP, o B-Naftil-P, a FMN e a Tyr-P foram os únicos hidrolisados significativamente com Km de 0,08 mmol L-1; 0,37 mmol L-1; 10,9 mmol L-1 e 0,51 mmol L-1, respectivamente. A análise dos parâmetros cinéticos na presença de BSA 1 mg mL-1 (no meio de diluição ou no meio de reação) para os substratos pNPP e B Naftil-P, mostrou um aumento na Km e na Vmax, enquanto que para a Tyr-P a Km diminuiu. A Km para a hidrólise da FMN não foi alterada. A Ea para a hidrólise do pNPP, na presença de BSA no meio de reação ou no meio de diluição, foi similar à obtida na ausência de BSA. Nos estudos de estabilidade térmica observamos que os diversos compostos testados (Pi, BS_ Glicerol e DTT) somente protegeram a enzima quando utilizados em conjunto. Isoladamente não houve proteção significativa. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto, e inibição por vanadato (Ki, 0,18 µmol L-1), piridoxal-5-P (Ki, 3,7 µmol L-I), Pi (Ki, 0,6 mmol L-1), molibdato de amônio (Kic, 0,1 mmol L-1 e Kia, 0,2 mmol L-1) e pCMB. Assim como para o pNPP, o vanadato era um inibidor competitivo com relação a FMN e Tyr-P, com valores de Ki de 0,34 nmol L-1 e 0,48µmol L-1, respectivamente
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Abstract: A low molecular weight sheep kidney protein tyrosine phosphatase was purified 1291-fold to homogeneity, with 4% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exc1usion chromatography. The...
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Abstract: A low molecular weight sheep kidney protein tyrosine phosphatase was purified 1291-fold to homogeneity, with 4% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exc1usion chromatography. The purified 1 ¿1 enzyme had a specific activity of 99.4 J!mol min mg . The pNPP hydrolysis reaction catalyzed by this enzyme had a broad pH optimum of 4.0-5.5 and maximal activity at 57°C. Reducing thiol compounds, metal ions and other different compounds did not significantly affect the enzyme activity except for the inhibition by Zn2+, CU2+, Hg2+, Ag+ and activation by guanosine. An activation energy value of 54.5 µmofl K-1 was determined from Arrhenius plot for the hydrolysis of pNPP. The apparent Km values obtained, at 37°C and pH 5.0, for the best substrates were 0.08 mmol L-1, 0.37 mmol L-1, 0.51 mmol L-1 and 10.9 mmol L-1 for pNPP, B-Naphthyl-P, FMN and Tyr-P, respectively. Kinetic parameters in the presence of 1 mg mL-1 BSA, in the reaction medium or in the enzyme dilution medium, showed an increase in Km and Vmax for the substrates pNPP and B-Naphthyl-P. For the substrates Tyr-P and FMN, the Km decreased or was not. affected, respectively. The activation energy was not also affected in the presence of BSA. The following compounds Pi, DTT, BSA, and glycerol only protected the enzyme against thermal inactivation if used together. The enzyme was inhibited by vanadate (Ki, 0.18 µmol L-1), pyridoxal-5-P (Ki, 3.7 µmol L-1), inorganic phosphate (Ki, 0.6 mmol L-1), ammonium molybdate (Kic, 0,1 mmol L-1 e Kia, 0,2 mmol L-1) and pCMB. Both tartrate and fluoride were ineffective inhibitors. As observed for pNPP, was a competitive inhibitor, in relation to FMN and Tyr-P, with the following Ki values: 0.34 nmol L-1 and 0.48 µmol L-1 respectively
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