Resumo: Embora haja um acelerado avanço no conhecimento da patogênese da COVID-19, ainda há lacunas significativas quanto às causas subjacentes às diferentes respostas dos pacientes durante a evolução dessa doença. Este cenário sugere a influência de fatores genéticos na maneira como cada indivíduo reage à infecção pelo SARS-CoV-2. Os elementos cis-regulatórios são os principais determinantes da especificidade da expressão gênica em diversos tipos celulares. Além disso, variantes genéticas nesses elementos cis-regulatórios já demonstraram associação com várias doenças, incluindo a COVID-19 severa. Este estudo, que é parte de um outro trabalho mais abrangente, utilizou-se de dados genéticos e epigenéticos de bancos públicos e, assim gerou evidências que sugerem que algumas variantes genéticas associadas à COVID-19 severa estão inseridas em putativos elementos cis-regulatórios de um gene associado a distúrbios de coagulação, como a trombose. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi conduzir testes com o propósito de validar funcionalmente determinadas regiões do gene ABO, e regiões próximas a ele, que foram identificadas como potenciais elementos cis-regulatórios do ADAMTS13, sendo este um gene que codifica uma proteína chave do processo de coagulação. No presente estudo foram utilizadas as células hepáticas HepG2 e LX-2. Foram realizados ensaios de ATAC-seq e, também, foram extraídas informações das bibliotecas virtuais abertas de ATAC-seq. Para testar o potencial de modulação de expressão gênica, as regiões de interesse foram clonadas em vetor pGL3 promoter, e ensaio por gene repórter luciferase foi realizado após transfecção nos dois tipos celulares. Além disso, foi realizado o ensaio de geração de embriões transgênicos utilizando o gene LacZ como gene repórter, para testar o potencial de atividade in vivo de uma das sequencias avaliadas. Como resultados, observou-se que no ATAC-seq a maioria das regiões preditas apresentava cromatina aberta em ambos os tipos de células. No ensaio de geração de embriões transgênicos, foram obtidos quatro embriões com coloração positiva, entretanto, não foi possível observar positivamente a presença de um enhancer nas marcações dos embriões. Já no ensaio com o gene repórter luciferase, foram observados resultados significativos (p < 0,05) ao comparar as leituras de atividade de luciferase em células LX-2 das regiões clonadas com o controle negativo. O tamanho do efeito da comparação da atividade de luciferase com o controle positivo e negativo de ambas as células foi grande, muito grande ou enorme. Dessa forma, concluímos que as regiões suspeitas de serem de elementos cis-regulatórios podem exercer um potencial efeito repressor de expressão de genes cuja conformação da cromatina demonstre uma aproximação com tais regiões, como é o caso do gene ADAMTS13 em células hepáticas Ver menos

Abstract: Although there has been faster progress in understanding the pathogenesis of COVID-19, significant gaps remain regarding the underlying causes of different patient responses during the course of this disease. This scenario suggests the influence of genetic factors on how each individual reacts to SARS-CoV-2 infection. Cis-regulatory elements are the primary determinants of gene expression specificity in various cell types. Furthermore, genetic variants in these cis-regulatory elements have been shown to be associated with various diseases, including severe COVID-19. This study, which is part of a broader investigation, utilized genetic and epigenetic data from public databases and generated evidence suggesting that some genetic variants associated with severe COVID-19 are located within putative cis-regulatory elements of a gene associated with coagulation disorders, such as thrombosis. In this context, the aim of this study was to conduct tests to functionally validate certain regions of the ABO gene, and regions nearby, which were identified as potential cis-regulatory elements of ADAMTS13, a gene encoding a key protein in the coagulation process. In this study, HepG2 and LX-2 hepatic cells were used. ATAC-seq assays were performed, and information was extracted from open virtual ATAC-seq libraries. To test the potential for gene expression modulation, the regions of interest were cloned into a pGL3 promoter vector, and the test luciferase reporter gene assays were conducted after transfection into both cell types. Additionally, a transgenic embryo generation assay using the LacZ gene as a reporter gene was performed to test the potential in vivo activity of one of the evaluated sequences. As results, it was observed that in ATAC-seq, most predicted regions showed open chromatin in both cell types. In the transgenic embryo generation assay, four embryos with positive staining were obtained, however, the presence of an enhancer in the embryo markings could not be positively observed. In the luciferase reporter gene assay, significant results (p < 0.05) were observed when comparing luciferase activity readings in LX-2 cells from cloned regions with the negative control. The effect size of the comparison of luciferase activity with both positive and negative controls in both cells was large, very large, or huge. Thus, we conclude that regions suspected to be cis-regulatory elements may exert a potential repressive effect on gene expression whose chromatin conformation demonstrates proximity to such regions, as is the case for the ADAMTS13 gene in hepatic cells Ver menos