Resumo: A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é o câncer mais comum na criança. Enquanto atualmente a taxa de cura dessa doença aproxima-se a 90%, as crianças que apresentam recaída ainda possuem um prognóstico ruim. A LLA é caracterizada pela proliferação clonal de precursores linfoides de linhagem B ou T (85% e 15% dos casos, respectivamente), células do sistema imunológico adaptativo responsáveis pela produção de moléculas receptoras de antígenos, como as imunoglobulinas (IG). A produção das cadeias que compõem essas moléculas depende de um processo de recombinação somática denominado rearranjo V(D)J, que gera sequências gênicas virtualmente únicas para cada nova célula linfoide formada. Assim, o sequenciamento V(D)J de uma determinada amostra celular permite discriminar os clones de células linfoides, como, por exemplo, no monitoramento da Doença Residual Mínima (DRM) na LLA. Exames de DRM baseados no sequenciamento V(D)J geram informação acerca do conjunto de clonótipos presentes na medula óssea do paciente, tanto os correspondentes às células leucêmicas quanto os correspondentes às células saudáveis da linhagem B e T. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo explorar o repertório de células linfoides de linhagem B em pacientes de LLA-B pediátrica e buscar associações dessas características com o desenvolvimento clínico dos pacientes. Para tal, sequenciou-se a região VDJ do gene IGH de amostras de medula óssea colhidas ao diagnóstico e após o término da terapia de indução de 204 pacientes consecutivos com LLA-B pediátrica. Como controle, foram utilizadas 8 amostras de medula óssea de doadores saudáveis da mesma faixa etária. O processamento e análise dos dados de rearranjos VDJ de IGH foi realizado por meio de uma pipeline desenvolvida nesta tese. Clonótipos associados a subtipos genéticos específicos de LLA-B apresentaram diversas diferenças na estrutura da junção das cadeias V-D-J em relação aos clonótipos de doadores, como, por exemplo, enriquecimento de certos segmentos VH; baixa utilização de segmentos localizados entre os segmentos IGHV7-34-1 e IGHV1-58 e maior frequência de nucleotídeos GC no subtipo ETV6::RUNX1; além de encurtamento da região CDR3 e das inserções de nucleotídeos N realizadas durante o rearranjo. Também comparou-se os clonótipos de células leucêmicas que desapareceram após terapia de indução (sensíveis) em relação àqueles das células leucêmicas resistentes. Aqui, observou-se que células leucêmicas resistentes ao tratamento tendem a apresentar rearranjos IGH não produtivos. Por fim, pacientes com menor diversidade de repertório IGH ao término da terapia de indução tendem a ser pacientes de alto risco pelo sistema NCI e apresentam uma pior sobrevida global e livre de eventos. Essa associação foi encontrada também quando analisando apenas os pacientes com DRM indetectável nesse ponto do tratamento, gerando informação clinicamente relevante para esse grupo de pacientes. De modo geral, esse conjunto de resultados contribuem para o avanço do entendimento do processo de rearranjo V(D)J em células de LLA-B, bem como da importância da diversidade da medula óssea no prognóstico dos pacientes Ver menos

Abstract: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common cancer in children. While current cure rates for this disease approach 90%, children who experience relapse still present a poor prognosis. ALL is characterized by the clonal proliferation of lymphoid progenitors of B or T lineage (85% and 15% of cases, respectively), cells of the adaptive immune system that are responsible for producing antigen receptor molecules, such as immunoglobulins (IG). The production of the chains that make up these molecules depends on a somatic rearrangement process known as V(D)J recombination, which generates virtually unique genetic sequences for each newly formed lymphoid cell. As such, the V(D)J sequencing of a cell sample allows the discrimination of lymphoid cell clones, as exemplified by Minimal Residual Disease (MRD) monitoring in ALL. MRD assays based on V(D)J sequencing also provide information about the whole clonotype set present in the patient’s bone marrow, including both those corresponding to leukemia cells and those corresponding to healthy B and T lineage cells. In this context, the aim of this study was to explore the B-lineage lymphoid cell repertoire in pediatric B-Cell Precursor ALL (BCP-ALL) patients and to seek associations between these characteristics and the clinical development of the patients. To this end, the VDJ region of the IGH gene was sequenced in bone marrow samples from the diagnosis and end of induction therapy time points, collected from 204 consecutive pediatric patients with BCP-ALL. Eight bone marrow samples from healthy donors of the same age range were used as control samples. The processing and analysis of the VDJ rearrangement data of IGH were performed using a pipeline developed in this thesis. Clonotypes associated with specific BCP-ALL genetic subtypes showed various differences in the structure of their V-D-J chain junction in comparison to donor clonotypes, such as enrichment in some VH segments; low usage of segments located between segments IGHV7-34-1 and IGHV1-58 and higher frequencies of GC nucleotides in the ETV6::RUNX1 subtype; in addition to shortening of the CDR3 region and of the N nucleotides inserted during rearrangement. Additionally, patients with BCP-ALL from the ETV6::RUNX1 subtype presented low usage of segments located between segments IGHV7-34-1 and IGHV1-58 and higher frequencies of GC nucleotides. Clonotypes associated with leukemia cells that disappeared after induction therapy (sensitive to treatment) were also compared to those from resistant leukemia cells. Here, it was observed that treatment-resistant leukemia cells tend to have non-productive IGH rearrangements. Finally, patients with a lower IGH repertoire diversity at the end of induction therapy tend to be classified as high risk in the NCI system and present worse overall and event-free survival. This association was also found when analyzing only patients with undetectable MRD at this time point, providing clinically relevant information for this group of patients. Overall, these results contribute to advancing the understanding of the V(D)J rearrangement process in BCP-ALL cells and the importance of bone marrow diversity in the patient’s prognosis Ver menos