Resumo: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética neuromuscular e progressiva, que acomete 1,3 para cada 10.000 meninos nascidos vivos. Distúrbios na biogênese e bioenergética mitocondrial, combinados com estresse oxidativo, influxo exacerbado de íons cálcio, processo inflamatório e alterações na via da autofagia, desempenham papéis fundamentais no comprometimento das fibras musculares de pacientes com DMD. Tanto a fotobiomodulação por diodo emissor de luz (LED), quanto o tratamento com o antioxidante Idebenona são conhecidos por estimular o transporte de elétrons mitocondriais, além de exercerem atividade sobre inflamação, estresse oxidativo e canais de cálcio. Diante do exposto, levantamos a hipótese que o tratamento em combinação das terapias de fotobiomodulação e antioxidante podem apresentar potencial efeito benéfico sobre o fenótipo da fibra muscular distrófica. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo analisar "in vitro" e "in vivo" os efeitos da terapia combinada de Idebenona e LED sobre as fibras musculares distróficas de camundongos mdx, modelo experimental da DMD. No estudo "in vitro" foi analisada a combinação da LEDterapia (LEDT) no comprimento de onda de 850 nm e da Idebenona na dose de 0,06µM sobre as culturas primárias de células musculares de camundongos mdx. Após 24 e 48 horas do tratamento, foram analisados a citotoxicidade celular; quantificação de íons de cálcio; análise do estresse oxidativo; quantificação de proteínas associadas à vias mitocondriais, transporte e tamponamento de cálcio e marcadores de autofagia por Western Blotting e reguladores de diferenciação celular por PCR real time. Para o estudo "in vivo" foram utilizados camundongos mdx, com 14 dias de vida pós-natal, submetidos à aplicação da luz LED no terço médio do músculo quadríceps femoral (3x/semana) e tratados com Idebenona (200mg/kg, diariamente) por um período de duas semanas. Após o tratamento, o músculo quadríceps femoral foi retirado e utilizado para análises morfológicas, bioquímicas e moleculares. O tratamento com Idebenona e LEDT tanto isolados quanto combinados, não demonstraram efeitos citotóxicos nas células musculares distróficas. Em relação às vias do cálcio, após o tratamento com Idebenona e LEDT, houve redução significativa do conteúdo de cálcio intracelular; calpaína 1, calsequestrina e sarcolipina. Além disso, foi observada uma redução significativa dos marcadores de estresse oxidativo (H2O2; 4-HNE; Lipofuscina e DHE). Em relação às vias de sinalização mitocondrial, foi observado um aumento significativo na capacidade oxidativa (pelos níveis de OCR e OXPHOS). Além disso, os níveis de PGC-1?, SIRT-1 e PPAR? foram significativamente maiores nas células musculares distróficas tratadas com Idebenona mais LEDT. Os tratamentos também modularam a autofagia através da regulação de (SQSTM1, Beclin e Parkin) e as vias de sinalização (AMPK e TGF-?). Concomitantemente, os tratamentos melhoraram a capacidade regenerativa reduzindo a degeneração muscular; regulando positivamente os níveis de miogenina e MHC-slow; e diminuindo os níveis de MyoD e MHC-fast. Os resultados obtidos demonstraram que a Idebenona e LEDT apresentam efeitos benéficos sobre as fibras musculares distróficas. Esses achados ilustram a potencial eficácia do tratamento com Idebenona e LEDT como uma terapia adjuvante na recuperação muscular do paciente distrófico Ver menos

Abstract: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a progressive neuromuscular genetic disease that affects 1.3 for every 10,000 live births. Disturbances in mitochondrial biogenesis and bioenergetics, combined with oxidative stress, exacerbated influx of calcium, inflammatory process and changes in autophagy play key roles in the impairment of muscle fibers in patients with DMD. Light emitting diode therapy (LEDT) photobiomodulation and treatment with antioxidant Idebenone are known to stimulate mitochondrial electron transport, in addition to exerting activity on inflammation, oxidative stress and calcium channels. In this way, we hypothesize that the treatment of photobiomodulation in combination with antioxidants may have a potential beneficial effect on the dystrophic muscle fiber phenotype. Therefore, the present study aimed to analyze "in vitro" and "in vivo" effects of the combined therapy of Idebenone and LED on dystrophic muscle fibers of mdx mice, an experimental model of DMD. In the "in vitro" study, a combination of LED therapy (LEDT) at a wavelength of 850 nm and Idebenone at a dose of 0,06µM was conducted on primary cultures of muscle cells from mdx mice. After 24 and 48 hours of treatment, the following tests were performed: cell cytotoxicity assays; quantification of calcium ions; analysis of oxidative stress; quantification of proteins associated with mitochondrial pathways, calcium transport and buffering, autophagy markers by Western Blotting and cell differentiation controllers by real time qPCR. For the "in vivo'' study, mdx mice were used with 14 days after birth, approved for the application of LEDT light in the middle third of the quadriceps muscle (3x/week) and treated with Idebenone (200mg/kg, daily) for a period of two weeks. After treatment, the quadriceps muscle was removed and used for morphological, biochemical, molecular and genetic analyses. Treatment with LEDT and Idebenone did not demonstrate cytotoxic effects on dystrophic muscle cells. Regarding calcium pathways, there was a significant reduction in intracellular calcium content; calpain 1, calsequestrin and sarcolipin after treatment with LEDT and Idebenone. In addition, a significant reduction in oxidative stress level markers such as H2O2 and 4-HNE levels was observed. Regarding mitochondrial signaling pathways, a significant increase in oxidative capacity (by OCR and OXPHOS levels) was observed. Furthermore, PGC-1?, SIRT-1 and PPAR? levels were significantly higher in dystrophic muscle cells treated with Idebenone plus LEDT. Treatment with Idebenone and LEDT also modulated autophagy by increasing autophagy markers (SQSTM1, Beclin and Parkin) and signaling pathways (AMPK and TGF-?). Concomitantly, the treatment combination improved regenerative capacity by reducing muscle degeneration; up-regulated myogenin and MHC-slow levels; and down-regulated MyoD and MHC-fast levels. These results showed that Idebenone and LEDT have beneficial effects on dystrophic muscle fibers. These findings illustrate the potential efficacy of treatment with LEDT and Idebenone as an alternative therapy in muscle recovery in dystrophic patients Ver menos