Resumo: Cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas de pluripotência induzida (hiPSC-CM) são obtidos a partir de uma nova tecnologia em que é possível reverter a diferenciação de células somáticas adultas e re-diferenciá-las em outro tipo celular. É grande o possível impacto da aplicação de hiPSC-CM como modelo in vitro de CM humano e em terapia celular, mas seu potencial pode ser limitado pela imaturidade morfológica e funcional dessas células, sendo o prolongamento do tempo de cultura uma das estratégias que podem promover a maturação. A elevação transitória da concentração citosólica de Ca2+ ([Ca2+]i) do CM (transiente de Ca2+) em resposta à excitação elétrica é o fenômeno que dispara a contração. Dado que a função de transportadores deste íon e sua interação mudam com o desenvolvimento, a análise do transporte de Ca2+ é uma abordagem relevante para avaliar a maturidade funcional de hiPSC-CM. Os objetivos desse trabalho foram: a) avaliar quantitativamente a contribuição dos transportadores de Ca2+ responsáveis pela fase de queda do transiente de Ca2+ (relaxamento) em hiPSC-CM; b) investigar a influência do tempo de cultura sobre variáveis relacionadas ao transporte de Ca2+ nessas células; c) avaliar a variabilidade dessas variáveis dentro e entre lotes de hiPSC-CM. Transientes de Ca2+ foram registrados em hiPSC-CM adquiridos comercialmente e cultivados por 2 e 3 semanas pós-diferenciação, carregados com o indicador fluorescente de Ca2+ indo-1. A razão da emissão em 410 e 485 nm (sob excitação de 365 nm) foi obtida durante contrações espontâneas e contraturas evocadas por cafeína, e posteriormente convertida a [Ca2+]i. Foram estimados os fluxos de Ca2+ carreados por sistema transportador, integrados durante o relaxamento, bem como a contribuição relativa de cada sistema. Os resultados indicaram que: a) o fluxo integrado total de Ca2+ removido no relaxamento de hiPSC-CM (~ 30 µmol/L) é semelhante ao de CM de ratos neonatos e de CM atriais humanos; b) as participações da ATPase de Ca2+ do retículo sarcoplasmático, do trocador Na+-Ca2+ e do conjunto de ATPase de Ca2+ do sarcolema e uniporter mitocondrial de Ca2+ são comparáveis aos de CM de mamíferos neonatos, e diferentes do observado em adultos; c) não houve diferença entre os valores das variáveis estudadas em células cultivadas por diferentes períodos; d) observou-se diferença significativa em todas as variáveis funcionais entre diferentes lotes, mas não dentro do mesmo lote para a maioria das variáveis. Com isso, conclui-se que os hiPSC-CM estudados apresentam um fenótipo imaturo no transporte de Ca2+, não ocorrendo maior maturação pelo prolongamento do tempo de cultura, o que indica a necessidade de outras estratégias para promover maior diferenciação para o padrão adulto. Conclui-se ainda que há variações importantes entre diferentes lotes, o que requer amostragem de vários deles para a obtenção de resultados reprodutíveis e confiáveis Ver menos

Abstract: Cardiomyocytes derived from human induced-pluripotent stem cells (hiPSC-CM) can be obtained with a new technology, in which it is possible to reverse the differentiation of adult somatic cells and redifferentiate them into another cell type. The possible application of hiPSC-CM as an in vitro model of human CM and in cell therapy has raised great expectation; however, suitability of these cells for such uses may be limited by the hiPSC-CM morphofunctional immaturity. Prolongation of the culture time has been proposed as a strategy to promote hiPSC-CM maturation. The transient elevation of the CM cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), known as "Ca2+ transient", in response to electric excitation is the trigger of contraction. Because CM Ca2+ transporters and their interaction undergo developmental changes, analyzing Ca2+ transport is a relevant approach to evaluate the functional maturity of hiPSC-CM. The goals of the present study were: a) to evaluate quantitatively the contribution of Ca2+ transporters involved in the decline of the Ca2+ transient (relaxation) in hiPSC-CM; b) to investigate the influence of culture time on variables related to Ca2+ transport in these cells; c) to assess the intra- and inter-batch variability of these variables. Ca2+ transients were recorded in commercially acquired hiPSC-CM, which were cultured for 2 and 3 weeks post-differentiation, after loading with the Ca2+ fluorescent indicator indo-1. The ratio of emission at 410 and 485 nm (under 365 nm excitation) was calculated during spontaneous contractures and caffeine-evoked contractures, and subsequently converted to [Ca2+]i. The Ca2+ fluxes carried by each transport system were estimated and integrated during relaxation, and the relative contribution of each system was calculated. The results indicated that: a) the total, integrated flux of Ca2+ removed from the cytosol during hiPSC-CM relaxation (~ 30 µmol/L) is similar to neonatal ventricular CM and adult human atrial CM; b) the contribution of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, of the Na+-Ca2+ exchanger and of the pooled sarcolemmal Ca2+ ATPase and mitochondrial Ca2+ uniporter are comparable to those in neonatal mammalian CM, and different from those observed in adults; c) there was no significant difference in the studied variables obtained from cells cultured for different periods; d) for all tested functional variables, significant inter-batch variation was detected, while non-significant inter-batch variation was observed for most variables. Thus, it was possible to conclude that the analyzed hiPSC-CM present an immature Ca2+ transport phenotype, which was not changed by culture prolongation, thus showing the need of other strategies to promote further differentiation toward the adult pattern. Important variation was also detected among different cell batches, which indicates that obtaining reproducible, reliable results requires sampling of several hiPSC-CM batches Ver menos