Resumo: Veículos nanoterapêuticos baseados em lipídios são uma solução promissora para superar as limitações atuais dos sistemas convencionais de administração de medicamentos ou genes. Apesar de seu vasto potencial, suas aplicações clínicas ainda são limitadas devido a impedimentos técnicos em síntese eficiente. A demanda pelo desenvolvimento de plataformas tecnológicas eficazes para a produção com alta produtividade desses compostos está aumentando rapidamente. Nesse contexto, a microfluídica emerge como uma ferramenta tecnológica robusta na síntese contínua de sistemas vetoriais baseados em lipídios para entrega de medicamentos ou genes. Esta tese de doutorado visa o desenvolvimento tecnológico de sistemas microfluídicos para incorporar pequenos RNA interferentes (siRNA) em lipossomas catiônicos (CLs) com propriedades furtivas (Stealth) e avaliar a transfecção de agentes nanoterapêuticos de siRNA em esferóides multicelulares, utilizando microchip. Na primeira parte, os CLs foram eletrostaticamente complexados com siRNA explorando o efeito da razão molar de cargas para entender como o siRNA interage com os lipossomas. Após análise através de espalhamento de luz dinâmica (DLS), a razão molar de cargas (R ±) ideal foi de 3,27. Nesta condição foram realizados ensaios de acessibilidade ao siRNA e eletroforese em gel de agarose. A multilamelaridade dos lipossomas foi confirmada por microscopia Crioeletrônica. Um efeito "knockdown" significativo da atividade da luciferase nas células HeLa foi obtido sem observar efeito citotóxico nas célula. Na segunda parte, CLs convencionais e furtivos foram produzidos em uma plataforma microfluídica de alto rendimento (baseada em advecção caótica) e avaliados aspectos físico-químicos, estruturais, morfológicos e biológicos desses sistemas lipídicos. As análises raio X a baixo ângulo (SAXS) e Cryo-TEM confirmaram a unilamelaridade dos CLs e os estudos de transfecção in vitro mostraram que eles poderiam fornecer pDNA às células cancerígenas. O processo desenvolvido alcançou uma produtividade 70 vezes maior na produção de CL em comparação com o processo de focalização hidrodinâmica em microfluídica. Além disso, este processo evitou com sucesso a formação de micelas nos microcanais, o que era inevitável em dispositivos de foco de fluxo hidrodinâmico. Também foi empregada a técnica de concentração à vácuo centrífugo como processo alternativo de destilação para remover o excesso de etanol na formulação lipossômica final, mantendo a estrutura unilamelar dos CLs. Na terceira parte, uma plataforma microfluídica baseada em difusão foi usada para sintetizar sistemas lipídicos contendo siRNA com propriedades furtivas, avaliando duas estratégias de processo: uma etapa (fosfolipídios e polímero PEG com siRNA para autoagregação lipídica e complexação com material genético simultaneamente) e duas etapas (CLs furtivos pré-formadas para associação com siRNA). Abordagens de uma e duas etapas levaram à síntese de nanocarreadores lipídicos com diferentes propriedades físico-químicas, estruturais e morfológicas. A análise SAXS confirmou que a inserção do PEG na formulação teve um impacto diferente nas propriedades estruturais. Na última parte, foram desenvolvidos microchips para a formação e transfeção de esferoides de células HEK-293 que expressam GPF em condição estática e dinâmica . Os esferóides foram transfectados usando siRNA no microdispositivo de cultivo em sistema estático. Os esferóides produzidos foram caracterizados morfologicamente utilizando técnicas avançadas de microscopia e os níveis de transfecção foram determinados pela avaliação da intensidade da GFP. Os estudos de transfecção mostraram que plataformas microfluídicas estáticas não eram eficazes para testar formulações de fámacos ou genes. Portanto, novas estratégias são propostas para superar a limitação dos microdispositivos estáticos. Esta dissertação fornece contribuições originais de grande importância no campo da microfluídica e sua aplicação na nanomedicina Ver menos

Abstract: Lipid-based nanotherapeutics are a promising solution to overcome the current limitations of conventional drug/gene delivery systems. Despite their vast potential, their clinical applications are still limited due to technical impediments in their efficient synthesis. The demand for the development of effective technological platforms for high-throughput production of these compounds is rapidly increasing. In this context, microfluidics emerged as a robust technological tool in the continuous synthesis of lipid-based vector systems for drug/gene delivery. This Ph. D. thesis aims the technological development of microfluidic systems to incorporate small interfering RNA (siRNA) into cationic liposomes (CLs) with stealth properties and on-chip transfection of multicellular spheroids with siRNA nanotherapeutics. In the first part, CLs were electrostatically complexed with siRNA using bulk mixing to better understand how siRNA interacts with liposomes. After our dynamic light scattering (DLS) analysis, the optimum molar charge ratio (R±) was found to be 3.27. This value was verified by employing siRNA accessibility assay and gel electrophoresis. The multilamellarity of the liposomes was confirmed using Cryo-electron microscopy. A significant knockdown of luciferase activity on HeLa cells was obtained with no cytotoxic effect. In the second part, conventional and stealth CLs were produced in a high-throughput microfluidic platform (chaotic advection-based) and physicochemical, structural, morphological and biological aspects of these lipid-based vector systems were evaluated. SAXS and Cryo-TEM analyses confirmed the unilamellarity of both CLs and in vitro transfection studies showed that they could deliver pDNA to the cancer cells. In this step, we achieved 70 times higher productivity in CL production compared to microfluidics hydrodynamic flow-focusing process. Moreover, we successfully eliminated the formation of micelle in the microchannels, which was inevitable in hydrodynamic flow-focusing devices. We also employed centrifugal vacuum concentrator as an alternative distillation process to remove the excess of ethanol in the final liposomal formulation, keeping the unilamellar structure of CLs. In the third part, a diffusion-based microfluidic platform was used to synthesize siRNA-containing lipid-based nanotherapeutics with stealth properties as one-step (phospholipids and PEG polymer with siRNA) and two-step (pre-formed stealth CLs with siRNA) approaches. One-step and two-step approaches led to the synthesis of lipid nanocarriers with different physico-chemical, structural, and morphological properties. SAXS analysis confirmed that the insertion of PEG into the formulation had a different impact on the structural properties. In the last part, static and dynamic microfluidic cell culture systems were developed to produce spheroids using GPF-expressing HEK-293 cells. The spheroids were transfected using siRNA on the selected microdevice (static system). Produced spheroids were morphologically characterized using advanced microscopy techniques and transfection levels were determined by evaluating GFP intensity. The transfection studies showed that static microfluidic platforms were not effective to test drug/gene formulations. Hence, new strategies are proposed to overcome the limitation of static microdevices. This dissertation provides original contributions of major significance in the field of microfluidics and its application in nanomedicine Ver menos