Resumo: A presente tese explorou a dinâmica da biotecnologia sustentável, focando na sinergia entre o uso de resíduos agroindustriais, tecnologia enzimática e alimentos funcionais. No centro desta pesquisa estão os xilo-oligosacarídeos (XOS), derivados de biomassa rica em xilana e valorizados por seu potencial prebiótico, promovendo a melhoria da função intestinal, resposta imunológica e outros benefícios à saúde. Esta tese investigou a conversão de três resíduos agroindustriais abundantes—casca de milho, cascas de soja e resíduos de processamento de laranja—em XOS e outros compostos bioativos, enfatizando o aumento da produção de XOS por meio da hidrólise de cascas de soja e milho utilizando uma nova enzima quimérica. Duas enzimas-chave foram fundidas para criar uma quimera bifuncional estável, com o objetivo de reduzir os custos de produção de enzimas e melhorar estabilidade e atividade enzimática. Resultados em destaque incluem a quimera bifuncional de ?-L-arabinofuranosidase GH 62 fundida com endoxilanase GH 10 em "Pichia pastoris". As investigações abrangeram perfis de hidrólise, condições ótimas, sinergia, especificidade e análises estruturais. GH 62 isoladamente revelou condições ótimas em pH 4,8 e 42 °C, com um efeito sinérgico notável quando associada com GH 10, resultando em um aumento de 2,3 vezes na produção de XOS e coprodução de 0,82 mM de ácido ferúlico e 0,09 mM de ácido 'alpha'-cumárico a partir de arabinoxilana da casca de milho. O design de uma enzima quimérica bifuncional integrando essas duas atividades demonstrou estabilidade e especificidade aprimoradas, alcançando até 7 g/L de XOS a partir de cascas de milho, e um aumento de 10 °C na temperatura de fusão para o módulo GH 62. Estratégias de evolução dirigida elevaram ainda mais a termostabilidade de GH 62, com o melhor mutante (G205K) apresentando um aumento de 5 °C na temperatura de fusão e me-lhoria de 41,3% na energia de desnaturação, estabelecendo bases para processos enzimáticos mais robustos. Análises bioinformáticas facilitaram a compreensão e a melhoria da estabilidade enzimática. A quimera apresentou especificidade superior para arabinoxilana, e a ação sinérgica dos dois domínios levou a melhorias nos rendimentos de xilobiose e xilotriose (15% e 33%, respectivamente). Esses avanços na hidrólise de arabinoxilana contribuíram para o avanço de processos enzimáticos sustentáveis, especialmente para a valorização de resíduos agroindustriais. Além disso, a pesquisa se estendeu à biorrefinaria de resíduos de laranja em um contexto distinto, demonstrando a viabilidade técnico-econômica para a produção de XOS, pectina e bioenergia, alcançando um custo de produção de $3,67/kg com mais de 60% de redução nos requisitos de energia e material. Análises revelaram os efeitos antioxidantes dos produtos, destacando a utilização sustentável de resíduos e o desenvolvimento de alimentos funcionais e nutracêuticos. Esta pesquisa ressaltou a importância de atender às demandas dos consumidores por produtos bioativos naturais, minimizando os impactos ambientais com novas intervenções tecnológicas. No geral, esta tese contribuiu para o avanço de formulações enzimáticas para bioprodutos sustentáveis, reforçando o potencial dos resíduos agrícolas como recursos valiosos em aplicações biotecnológicas Ver menos

Abstract: The present thesis explored the dynamics of sustainable biotechnology, focusing on the synergy between the use of agro-industrial residues, enzymatic technology, and functional foods. At the heart of this research are xylo-oligosaccharides (XOS), derived from xylan-rich biomass and valued for their prebiotic potential, promoting improved intestinal function, immune response, and other health benefits. This thesis investigated the conversion of three abundant agro-industrial residues—corn husks, soybean hulls, and orange processing residues—into XOS and other bioactive compounds, emphasizing increased XOS production through hydrolysis of soybean hulls and corn husks using an innovative chimeric enzyme. Two pivotal enzymes were fused to create a stable bifunctional chimera aimed at reducing enzyme pro-duction costs and enhancing enzymatic stability and activity. Highlighted results include the bifunctional chimera of 'alpha'-L-arabinofuranosidase GH 62 fused with endoxylanase GH 10 in "Pichia pastoris". Investi-gations covered hydrolysis profiles, optimal conditions, synergy, specificity, and structural analyses. GH 62 alone revealed optimal conditions at pH 4.8 and 42 °C, with a notable synergistic effect when paired with GH 10, resulting in a 2.3-fold increase in XOS production and the co-production of 0.82 mM ferulic acid and 0.09 mM p-coumaric acid from corn hull arabinoxylan. The design of a bifunctional chimeric enzyme integrating these two activities demonstrates enhanced stability and specificity, achieving up to 7 g/L of XOS from corn husks, while maintaining superior thermostability with a 10 °C increase in melting temperature for the GH 62 module. Directed evolution strategies further improve the thermostability of GH 62, with the best mutant (G205K) exhibiting a 5°C increase in melting temperature and a 41.3% enhancement in denaturation energy, laying the groundwork for more robust enzymatic processes. Bioinformatics analyses facilitated the systematic understanding and enhancement of enzymatic stability. The designed chimera exhibited superior specificity for arabinoxylan, and the synergistic action of the two domains led to significant improvements in xilobiose and xylotriose yields (15% and 33%, respectively). These advancements in arabinoxylan hydrolysis contributed to the understanding of enzymatic properties and the advancement of sustainable enzymatic processes, especially for the valorization of agro-industrial residues. Additionally, the research extended to the biorefinery of orange waste in a distinct framework, demonstrating the techno-economic feasibility for XOS, pectin, and bioenergy production, achieving a production cost of $3.67/kg with over 60% reduction in energy and material requirements. Analyses revealed the antioxidant effects of the products, highlighting the sustainable utilization of residues and the development of functional foods and nutraceuticals. This research under-scores the importance of meeting consumer demands for natural bioactive products, while minimizing environmental impacts through innovative technological interventions. Overall, this thesis contributed to the advancement of enzymatic formulations for sustainable bioproducts, reinforcing the potential for agricultural residues as valuable resources in biotechnological applications Ver menos