Caracterização do efeito in vitro do inibidor dos transportadores de efluxo, MK571, na presença de substâncias que aumentam os níveis de AMPc e GMPc em bexiga urinária de porco
Erick de Toledo Gomes
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP G585c
[Characterization of the in vitro effect of the efflux transporter inhibitor, MK571, in the presence of substances that increase cAMP and cGMP levels in pig urinary bladder]
Campinas, SP : [s.n.], 2023.
1 recurso online (75 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Fabíola Taufic Mónica Iglesias
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: Introdução: Transportadores de efluxo são proteínas transmembranares que podem transportar substâncias para o meio intra- ou extracelular e têm relevância clínica devido à resistência a fármacos ou ao transporte de substâncias endógenas. MRP4 e MRP5 (codificados pelos genes ABCC4 e ABCC5)...
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Resumo: Introdução: Transportadores de efluxo são proteínas transmembranares que podem transportar substâncias para o meio intra- ou extracelular e têm relevância clínica devido à resistência a fármacos ou ao transporte de substâncias endógenas. MRP4 e MRP5 (codificados pelos genes ABCC4 e ABCC5) têm como substrato, dentre outros mediadores endógenos, os nucleotídeos cíclicos, AMPc e GMPc, essenciais como segundos mensageiros intracelulares. MK571, classificado como antagonista dos receptores de leucotrieno e como inibidor não seletivo dos transportadores MRP4 e MRP5 é proposto como ferramenta farmacológica para avaliar tais atividades. A justificativa deste trabalho baseia-se, primeiramente, em resultados que demonstraram que o MK571 potencializou o relaxamento de substâncias que aumentam os níveis de nucleotídeos no trato geniturinário de camundongos, além da expressão de MRP4 e co-expressão de MRP5 e PDE5 em bexiga humana. A hipótese é que o uso do MK571, em presença de substâncias que elevam os níveis de nucleotídeos cíclicos na bexiga, cause aumento intracelular desses nucleotídeos, potencializando o relaxamento. Metodologia: Foram usadas bexigas urinárias isoladas de porcos. Foi avaliada a expressão gênica de ABCC4 e ABCC5, imunomarcação de MRP4 e curvas concentração-resposta de substâncias que aumentam os níveis de AMPc e GMPc, na ausência e presença de MK571 20 µM. Foi realizada a quantificação de nucleotídeos cíclicos intracelulares e extracelulares, além da expressão proteica de p-VASPSer239 e VASP sob estímulo de tadalafil + BAY 41-2272, com ou sem MK571 20 µM. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, N= 5-7 animais. Resultados: O gene ABCC4, mas não o ABCC5, está expresso em amostras de bexiga urinária de porco. A análise qualitativa da proteína MRP4 mostrou imunomarcação no detrusor, urotélio, estruturas neurais no interstício e em fibroblastos, com expressão equivalente tanto nos fibroblastos quanto nas estruturas neurais, porém, mais elevada em comparação ao urotélio e ao músculo liso, onde a expressão é similar. Os relaxamentos induzidos pelo MK571 e montelucaste foram de, aproximadamente, 26% e 25%, respectivamente. Montelucaste não potencializou relaxamento frente ao cilostazol ou tadalafil. MK571 potencializou resposta frente a inibidores de PDEs, como sildenafil, tadalafil e cilostazol, os quais induziu um deslocamento significativo das curvas, em aproximadamente 2.8, 3.9 e 4.5 vezes para a esquerda, respectivamente. As substâncias que aumentam os níveis de AMPc não exibiram um aumento correspondente em suas respostas na presença de MK571. Verificamos que as concentrações intracelulares e extracelulares de AMPc aumentam em aproximadamente 15,8 e 12 vezes, respectivamente, após 60 minutos no estímulo com forscolina, enquanto as concentrações intracelulares e extracelulares de GMPc aumentam em aproximadamente 8,2 e 3,4 vezes, respectivamente, após 60 minutos no estímulo com tadalafil + BAY 41-2272. O MK571 promoveu um aumento significativo na razão p-VASP Ser239/VASP, marcador da atividade da proteína quinase G, em tecidos estimulados com tadalafil + BAY 41-2272, em relação ao tecido estimulado sem MK571. Conclusão: Este é o primeiro trabalho a demonstrar a expressão do transportador de efluxo MRP4 em bexiga urinária de porco e que possui atividade biológica nesse tecido. Os dados aqui apresentados abrem novos caminhos para futuros estudos com modelos experimentais de bexiga hiperativa e amostras de bexiga humana para validar o potencial terapêutico na utilização concomitante de inibidor dos transportadores de efluxo e medicamentos já em uso na prática clínica, como sildenafil, tadalafil e cilostazol
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Abstract: Introduction: Efflux transporters are transmembrane proteins that can transport substances into or out of cells and have clinical relevance due to drug resistance or the transport of endogenous substances. MRP4 and MRP5 (encoded by the genes ABCC4 and ABCC5) have, among other endogenous...
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Abstract: Introduction: Efflux transporters are transmembrane proteins that can transport substances into or out of cells and have clinical relevance due to drug resistance or the transport of endogenous substances. MRP4 and MRP5 (encoded by the genes ABCC4 and ABCC5) have, among other endogenous mediators, cyclic nucleotides, cAMP and cGMP, which are essential as intracellular second messengers. MK571, classified as a leukotriene receptor antagonist and a non-selective inhibitor of MRP4 and MRP5 transporters, is proposed as a pharmacological tool to evaluate such activities. The justification for this study is primarily based on results that demonstrated that MK571 potentiated the relaxation of substances that increase nucleotide levels in the genitourinary tract of mice, as well as the expression of MRP4 and co-expression of MRP5 and PDE5 in human bladder. The hypothesis is that the use of MK571 in the presence of substances that elevate cyclic nucleotide levels in the bladder causes intracellular increase of these nucleotides, enhancing relaxation. Methodology: isolated pig urinary bladders were used. Gene expression of ABCC4 and ABCC5, MRP4 immunostaining, and concentration-response curves of substances that increase cAMP and cGMP levels were evaluated in the absence and presence of MK571 20 µM. Intracellular and extracellular cyclic nucleotide quantification was performed, along with protein expression of p-VASPSer239 and VASP under tadalafil + BAY 41-2272 stimulation, with or without MK571 20 µM. Results were expressed as mean ± standard deviation, N= 5-7 animals. Results: Gene ABCC4, but not ABCC5, is expressed in pig urinary bladder samples. Qualitative analysis of MRP4 protein showed immunostaining in the detrusor, urothelium, neural structures in the interstitium, and fibroblasts, with equivalent expression in fibroblasts and neural structures but higher compared to urothelium and smooth muscle, where expression is similar. Relaxations induced by MK571 and montelukast were approximately 26% and 25%, respectively. Montelukast did not potentiate relaxation in the presence of cilostazol or tadalafil. MK571 potentiated responses to PDE inhibitors such as sildenafil, tadalafil, and cilostazol, inducing a significant leftward shift in the concentration-response curves, approximately 2.8, 3.9, and 4.5 times, respectively. Substances that increase cAMP levels did not show a corresponding increase in their responses in the presence of MK571. We found that intracellular and extracellular concentrations of cAMP increased approximately 15.8- and 12-fold, respectively, after 60 minutes of forskolin stimulation, while intracellular and extracellular cGMP concentrations increased approximately 8.2- and 3.4-fold, respectively, after 60 minutes of tadalafil + BAY 41-2272 stimulation. MK571 significantly increased the p-VASP Ser239/VASP ratio, a marker of protein kinase G activity, in tissues stimulated with tadalafil + BAY 41-2272 compared to tissue stimulated without MK571. Conclusion: This is the first study to demonstrate the expression of the efflux transporter MRP4 in pig urinary bladder and its biological activity in this tissue. The data presented here open new avenues for future studies with experimental models of overactive bladder and human bladder samples to validate the therapeutic potential of concurrent use of efflux transporter inhibitors and medications already in clinical practice, such as sildenafil, tadalafil, and cilostazol
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