Resumo: Os arbovírus, vírus transmitidos por artrópodes, são patógenos que circulam majoritariamente em áreas tropicias e subtropicais em ciclos enzoóticos silvestres com baixos níveis de transmissão. A emergência e reemergência dessas arboviroses estão relacionadas a alterações em fatores como mudanças ambientais, estrutura populacional e mutações genéticas virais. Em humanos, as doenças causadas por arbovírus se manifestam inicialmente de forma inespecífica como síndromes febris agudas, podendo evoluir para quadros de maior complexidade e gravidade como: febres hemorrágicas, encefalites, comprometimento congênito, bem como doenças inflamatórias crônicas neurológicas ou articulares. Apesar de serem doenças autolimitantes, não há tratamento específico para casos graves e/ou crônicos desencadeado pela infecção destes patógenos. Para o desenvolvimento de tratamentos ou vacinas o entendimento da biologia básica desses vírus se faz necessário. No presente trabalho realizamos a elucidação da estrutura das partículas de MAYV (alphavirus) e de SLEV (flavivirus) a partir da geração de amostras purificadas e realização de criomicroscopia. A resolução da estrutura do MAYV a 4,4 Å revelou características da organização da partícula conservadas entre MAYV e outros alphavirus, como a presença de resíduos de glicosilação nas proteínas do envelope E1 e E2. A predição de interação destes resíduos com o receptor Mxra8 os projeta como alvos importantes que podem afetar a relação entre vírus e célula hospedeira, bem como a relação com anticorpos. Além disso, a comparação dos ectodomínios de E1 e E2 de MAYV e CHIKV revelou a perda de resíduos importantes em MAYV que podem ser explorados no desenvolvimento racional de anticorpos de alta especificidade. Diferentemente de MAYV, a resolução da estrutura de SLEV revelou características similares as descritas previamente na literatura para outros flavivirus. A partir de amostras de SLEV purificado foi possível observar que aproximadamente 63% da amostra era composta por partículas imaturas e 37% de partículas maduras. A estrutura da partícula madura foi obtida a uma resolução de a 3,8 Å e a partícula imatura a 7,6 Å. A comparação entre as duas estruturas de SLEV possibilitou a observação da diferença de posicionamento das proteínas E, prM e M após a maturação da partícula. Ademais, foi possível observar o resíduo de glicosilação N154 no domínio dois da proteína E, bem como o pocket hidrofóbico na região do loop de fusão. Devido à lacuna de alternativas terapêuticas para a febre do Mayaro e, de maneira a complementar o estudo estrutural, desenvolvemos um modelo de imunização com MAYV purificado para a geração de anticorpos monoclonais anti-MAYV usando a tecnologia de hibridomas. Ao todo, 14 animais foram imunizados, entretanto apenas 8 apresentaram anticorpos com atividade neutralizante contra MAYV in vitro. Ao todo 752 hibridomas foram gerados, com seleção de 47 hibridomas IgG anti-MAYV positivos, sendo 90% do tipo IgG1 e 10% IgG2b. Todavia, tais hibridomas demonstraram capacidade proliferativa limitada ou ausência de atividade neutralizante após manejo da cultura, impossibilitando análises mais avançadas. Em suma, neste trabalho, estabelecemos protocolos de purificação capazes de gerar estoques de partículas virais infecciosas aplicáveis ao estudo da biologia do arbovírus em diversos aspectos, incluindo a elucidação estrutural e estudos de imunização. A resolução da estrutura de MAYV e SLEV foram inéditas, gerando informações aplicáveis ao estudo da biologia básica dos vírus, desenvolvimento racional de terapias, imunização e diagnóstico Ver menos

Abstract: Arboviruses, viruses transmitted by arthropods, are pathogens that remain circulating with low levels of transmission in sylvatic enzootic cycles, mostly in tropical and subtropical areas. However, the increased risk of exposure, emergence, and reemergence of these arboviral diseases is related to the occurrence of one or more changes in factors such as environmental changes, population structure, and genetic factors. Diseases caused by arboviruses in humans begin nonspecifically as acute febrile syndromes, which can progress to more complex and severe conditions such as hemorrhagic fevers, encephalitis, congenital impairment, as well as chronic inflammatory neurological or joint diseases. Although these are self-limiting diseases, there is no specific treatment for severe and/or chronic cases triggered by infection with these pathogens. In order for treatments or vaccines to be developed, the basic biology of these viruses needs to be further explored. In the present study, we elucidated the structure of MAYV (Alphavirus) and SLEV (Flavivirus) particles through the generation of purified samples and cryo-electron microscopy. The resolution of the MAYV structure at 4.4 Å revealed particle organization characteristics common to MAYV and other alphaviruses, as well as the observation of conserved glycosylation residues in the E1 and E2 envelope proteins. The observation of the involvement of these residues in interaction with the MXRA8 receptor reveals important targets that can affect virus infection in the host cell, as well as its interaction with antibodies. Additionally, the comparison of the E1 and E2 ectodomains of MAYV and CHIKV revealed the loss of important residues in MAYV that can be exploited in the rational development of highly specific antibodies. Unlike MAYV, the resolution of the SLEV structure revealed characteristics similar to those previously described in the literature for other flaviviruses. From purified SLEV samples, it was possible to observe that approximately 63% of the sample consisted of immature particles and 37% of mature particles. However, the resolution of the mature particle was 3.8 Å and the immature particle was 7.6 Å, since the immature particle has greater flexibility, making resolution more difficult. The comparison between the structures of SLEV allowed the observation of differences in the positioning of the E, prM, and M proteins after particle maturation. Moreover, it was possible to observe the glycosylation residue N154 in the second domain of the E protein, as well as the hydrophobic pocket in the fusion loop region. Complementing the structural study, due to the gap in therapeutic alternatives for Mayaro fever, we developed an immunization model with purified MAYV for the generation of anti-MAYV monoclonal antibodies using hybridoma technology. In total, 14 animals were immunized, however, only 8 showed in vitro neutralizing activity against MAYV. A total of 752 hybridomas were generated, with the selection of 47 positive anti-MAYV IgG hybridomas, 90% of which were IgG1 and 10% IgG2b. However, these hybridomas demonstrated limited proliferative capacity or absence of neutralizing activity after culture handling, preventing further analysis. In summary, in this work, we established purification protocols capable of generating stocks of mature and infectious viruses applicable to the study of arbovirus biology in various aspects, including structural elucidation and immunization studies. The resolution of the MAYV and SLEV structures was unprecedented, generating information applicable to the study of the basic biology of viruses, rational therapy development, immunization, and diagnosis Ver menos