Resumo: As catecolaminas são compostos orgânicos que possuem em sua estrutura um grupo catecol (3,4-diidroxibenzeno) ligado por uma ponte de etil a um grupo de amina. As catecolaminas são presentes no sistema nervoso simpático periférico, na medula adrenal, e são distribuídas em várias regiões do sistema nervoso central. Dopamina, norepinefrina e epinefrina são as principais catecolaminas, formando uma classe de neurotransmissores químicos e hormonais. A primeira indicação de produção endógena de nitrocatecolamina surgiu ao observar que os níveis de noradrenalina detectados por microdiálise do núcleo paraventricular hipotalâmico de ratos diminuíam após a perfusão do tecido com uma solução contendo óxido nítrico (NO). A liberação basal de 6-nitrodopamina (6-ND), medida por espectroscopia de massa em tandem por eletropulverização positiva para HPLC (HPLC-MS/MS), foi identificada em diversos tecidos vasculares in vitro: artéria e veia umbilical humanas, artéria e veia poplítea humanas, aorta de Chelonoidis carbonaria, aorta de Pantherophis guttatus e artéria e aorta pulmonar obtidas do sagui Callitrix spp. Além dos tecidos vasculares, a liberação basal de 6-ND foi observada em átrio direito isolado de rato, átrios e ventrículos direitos isolados de camundongo, átrios e ventrículos isolados de coelho, ducto deferente isolado de rato e ducto deferente isolado humano. A 6-ND liberada pelos canais deferentes de ratos e humanos é considerada um importante mediador da contratilidade de ambos os tecidos. Antidepressivos tricíclicos e antagonistas de receptores ?1-adrenérgicos bloqueiam as contrações provocadas pela 6ND de maneira seletiva. A molécula de óxido nítrico (NO) apresenta um dos menores pesos moleculares entre os produtos de secreção celular de mamíferos. O NO apresenta uma meia-vida curta e pouca especificidade em suas reações. A presença do NO é importante para a síntese das nitrocatecolaminas, inclusiva a 6-ND. A síntese do óxido nítrico é atribuída principalmente à enzima óxido nítrico-sintase (NOS). Existem três isoformas conhecidas de NOS, incluindo uma isoforma induzida (iNOS) e duas isoformas constitutivas (cNOS). Essa enzima se encontra no citosol e precisa de cofatores como o tetrahidrobiopterina (BH4), o heme, a flavina adenina dinucleotídeo (FAD), a flavina mononucleotídeo (FMN) e o NADPH. A cNOS basal é estimulada pelo aumento na concentração celular de cálcio em decorrência da ativação de receptores na superfície celular e dos mecanismos de transdução de sinal. A administração de glicocorticoides não afeta sua síntese. Por outro lado, a iNOS requer uma concentração de cálcio muito baixa para ativação, mas a síntese de mRNA da iNOS é indispensável para sua atividade. A existência dessas diferentes isoformas de NOS levanta a dúvida de qual delas é a mais envolvida na síntese de NO e, por consequência, da 6ND no ducto deferente dos camundongos. Na investigação das câmaras cardíacas de camundongos, observou-se que a liberação basal de 6-ND é notavelmente reduzida em camundongos eNOS-/-, enquanto não apresenta essa redução em camundongos nNOS-/- ou iNOS-/-. Isso sugere a importância da eNOS na síntese de 6-ND nessas câmaras cardíacas. Para elucidar essa questão, examinamos a liberação basal de 6-ND em camundongos controle, eNOS-/-, nNOS-/- e iNOS-/-, a fim de determinar qual isoforma da NOS desempenha um papel crucial na biossíntese de 6-ND no ducto deferente de camundongos. Ductos isolados de dois animais de cada grupo foram suspensos em um banho de órgão com 3 mL de KHS e ácido ascórbico (3 mM) gaseificado continuamente com uma mistura (95% O2 / 5% CO2) a 37 ºC por 30 min. Os ductos deferentes foram incubados na ausência e presença da tetrodotoxina (TTX, 1 ?M) e 2 mL do sobrenadante foram enviados para análise. O procedimento utilizado para a quantificação da 6-nitrodopamina foi adaptado para possibilitar a mensuração das quatro catecolaminas (6-nitrodopamina, dopamina, noradrenalina e adrenalina) em uma única análise cromatográfica. Em uma abordagem adicional, os níveis de 6-nitrodopa, 6-cianodopamina e 6-nitroadrenalina foram igualmente quantificados em uma única execução cromatográfica. Uma segunda etapa da pesquisa, envolveu o estudo da contratilidade in vitro dos canais deferentes após estimulação por campo elétrico (EFS) antes a após incubação com L-NAME. Para tanto, os ductos eram preparados separadamente em um banho de órgão específico e, após um período de estabilização, os estímulos elétricos eram aplicados e a tensão isométrica exercida pelos ductos deferentes era registrada pelo o sistema PowerLab. A liberação basal de 6-ND mostrou-se significativamente reduzida em camundongos nNOS-/- em comparação com os camundongos controle, porém não houve diminuição quando os canais deferentes foram obtidos de camundongos eNOS-/- ou iNOS-/- . A pré-incubação dos canais deferentes com tetrodotoxina (1 ?M) resultou em uma redução significativa da liberação basal de 6-ND em camundongos controle, eNOS-/- e iNOS-/- , mas não apresentou efeito na liberação basal de 6-ND em camundongos nNOS-/- .O estímulo elétrico induziu contrações dependentes da frequência aplicada. Interessantemente os animais nNOS-/- mostraram uma redução significativa da força de contração a partir de 4Hz de energia aplicada, enquanto os animais controle, iNOS-/- e eNOS-/- mostraram a mesma capacidade contrátil em todas as frequências aplicadas. A pré incubação com L-NAME gerou redução na capacidade contrátil dos camundongos controle, iNOS-/- e eNOS-/-, mas não alterou a força gerada pelos camundongos nNOS-/-, a qual já estava reduzida. Os resultados deixam claro de maneira clara que a isoforma nNOS desempenha o papel principal na liberação de óxido nítrico (NO) no ducto deferente de camundongos, reafirmando assim a importância do 6-ND como um modulador significativo da contratilidade desse ducto Ver menos

Abstract: Catecholamines are organic compounds that have in their structure a catechol group (3,4-dihydroxybenzene) linked by an ethyl bridge to an amine group. Catecholamines are found in the peripheral sympathetic nervous system, adrenal medulla, and distributed throughout various regions of the central nervous system. The main catecholamines are dopamine, norepinephrine, and epinephrine, constituting a class of chemical and hormonal neurotransmitters. The initial indication of endogenous nitrocatecholamine production emerged from observations that levels of noradrenaline, detected through microdialysis of the hypothalamic paraventricular nucleus in rats, reduced after perfusing the tissue to a solution containing nitric oxide (NO). Basal release of 6-nitrodopamine (6-ND), assessed by HPLC-positive electrospray tandem mass spectroscopy (HPLC-MS/MS), was identified in various tissues in vitro: human umbilical artery and vein, artery and human popliteal vein, aorta from Chelonoidis carbonaria, pulmonary artery and aorta obtained from the marmoset Callitrix spp, and aorta from Pantherophis guttatus. Apart from blood vessel tissues, basal secretion of 6-ND was measured in isolated rat right atrium, isolated mouse right ventricles and atria, isolated rabbit ventricles and atria, isolated rat vas deferens and isolated human vas deferens. 6-ND released by the vas deferens of rats and humans is considered an important mediator of the contractility of both tissues. Tricyclic antidepressants and ?1-adrenergic receptor antagonists selectively block contractions induced by 6-ND. The nitric oxide (NO) molecule has one of the lowest molecular weights among mammalian cellular compression products. NO has a short half-life and little specificity in its reactions. The presence of NO is important for the synthesis of nitrocatecholamines, including 6-ND. The synthesis of nitric oxide is mainly attributed to the enzyme nitric oxide synthase (NOS). Three NOS isoforms are described, one induced (iNOS) and two constitutive (cNOS). This enzyme is present in the cytosol and requires NADPH, tetrahydrobiopterin (BH4), flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin mononucleotide (FMN) and heme as cofactors. Basal cNOS is activated by an increase in intracellular calcium concentration in response to the activation of cell surface receptors and signal transduction mechanisms. Its synthesis is not affected by the administration of glucocorticoids. In contrast, iNOS requires a very low calcium concentration for activation, but iNOS mRNA synthesis is indispensable for its activity. The existence of these different NOS isoforms raises the question of which one is most involved in the synthesis of NO and, consequently, 6ND in the vas deferens of mice. In the investigation of mouse cardiac chambers, it was observed that the spontaneous release of 6-ND is significantly reduced in eNOS-/- mice, while it is not evident this reduction in iNOS-/- or nNOS-/- mice. This implies the significance of eNOS in the generation of 6-ND within the heart of theses animeals. To elucidate this matter, we examined the spontaneous release of 6-ND in control mice, iNOS-/-, eNOS-/-, and nNOS-/- mice to ascertain which NOS isoform is integral in the biosynthesis of 6-ND in mice vas deferens. Isolated ducts from two animals from each group were suspended in an organ bath with 3 mL of KHS and ascorbic acid (3 mM) continuously gassed with a mixture (95% O2 / 5% CO2) at 37 ºC for 30 min. The vas deferens were incubated in the absence and presence of tetrodotoxin (TTX, 1 ?M) and 2 mL of the supernatant was sent for analysis. The procedure employed for the quantification of 6-nitrodopamine was modified to allow the measurement of the four catecholamines (6-nitrodopamine, dopamine, norepinephrine, and epinephrine) in a single chromatographic analysis. In an additional approach, the levels of 6-cyanodopamine, 6-nitroadrenaline, and 6-nitrodopa were also quantified in one chromatographic analysis. A second stage of the research involved the study of in vitro contractility of the vas deferens after electric field stimulation (EFS) before and after incubation with L-NAME. To this end, the ducts were prepared separately in a specific organ bath and, after a period of stabilization, electrical stimuli were applied and the isometric tension exerted by the vas deferens was recorded by the PowerLab system. The release of 6-ND exhibited a significant decrease in nNOS-/- mice compared to control mice. However, no reduction was observed when vas deferens were acquired from iNOS-/- or eNOS-/- mice. Pre-incubation of vas deferens with TTX resulted in a notable reduction in the release of 6-ND in control mice, iNOS-/-, and eNOS-/- mice, but had no impact on the release of 6-ND in nNOS-/- mice. EFS induced frequency-dependent contractions of the tissue. Interestingly, nNOS-/- animals showed a significant reduction in contraction force from 4Hz of applied energy, while control, iNOS-/- and eNOS-/- animals showed the same contractile capacity at all applied frequencies. Pre-incubation with L-NAME generated a reduction in the contractile capacity of control, iNOS-/- and eNOS-/- mice, but did not alter the force generated by nNOS-/- mice, which was already reduced. The findings unequivocally indicate that nNOS is the primary NO isoform accountable for the release of 6-ND in the mouse vas deferens. These results further underscore the significance of 6-ND as a crucial regulator of vas deferens contractility Ver menos