Resumo: O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus emergente responsável por milhares de casos de doença febril exantemática na região Amazônica. Como outros arbovírus, OROV pode causar complicações neurológicas em uma parte dos pacientes infectados. Embora tenha sido demonstrado que OROV pode atravessar a barreira hematoencefálica (BHE) e causar infecção no sistema nervoso central (SNC) de camundongos neonatos e hamsters, pouco se sabe sobre os mecanismos patogenéticos associados à quebra dessa barreira. Já foi demonstrado que IRF-5, um fator de transcrição ativado após reconhecimento de PAMPs (padrões moleculares associados a patógenos), é essencial no controle da neuroinvasão de OROV e outros arbovírus como WNV e LACV. Dessa forma, o objetivo deste projeto foi caracterizar o papel da expressão de IRF-5 em células endoteliais para o controle da neuroinvasão por OROV e explorar os fatores associados à infecção viral no SNC. Para tanto, analisamos a mortalidade, o tropismo viral e o infiltrado leucocitário no SNC de animais que não expressam IRF-5 em endotélio, utilizando o sistema Cre/LoxP de recombinação. Também caracterizamos a infecção por OROV e a expressão de genes da resposta imune inata e fatores de adesão endotelial em linhagens estabelecidas de células endoteliais. Além disso, examinamos o efeito de IRF-5 na integridade e passagem de vírus pela barreira endotelial e por modelos complexos que mimetizam a BHE. Por fim, utilizamos técnicas de bio-plex e RNA-seq para explorar a resposta de células humanas do SNC na infecção por OROV. Os resultados mostraram que 35% dos animais nocautes condicionais são vulneráveis à infecção, apresentando sinais de acometimento neurológico, como perda de equilíbrio e paralisia dos membros inferiores, alta carga viral no SNC (entre 104 e 108 eqFFU/g) e aumento do número e adesão de células imunes a microvasculatura cerebral, mesmo quando a infecção ocorre por meio da transferência de células imunes circulantes infectadas. Dessa forma, concluímos que a expressão e ativação de IRF-5 em células endoteliais é essencial para restringir o acesso ao SNC e a consequente quebra da BHE durante a infecção por OROV in vivo. Além disso, OROV infecta de forma produtiva as linhagens estabelecidas de células endoteliais de humanos (HBEC-5i) e murinos (BEND3). Enquanto as células HBEC-5i são altamente suscetíveis e permissivas à infecção por OROV, alcançando títulos entre 105 e 106 FFU/mL, as células BEND3 são parcialmente resistentes à infecção, com menor quantidade extracelular do vírus atingindo um máximo de 104 FFU/mL e sem efeito citopático aparente. Também foi possível observar uma forte resposta antiviral nas células endoteliais infectadas, com aumento da expressão de vias de sinalização, genes estimulados por interferon (ISGs) e fatores de adesão endotelial (ICAM, VCAM, e-selectina e p-selectina). Ainda assim, não houve modulação na expressão de junções oclusivas ou disrupção da barreira endotelial in vitro, apesar de ser possível recuperar vírus na câmara inferior em modelos de transwell, indicando que o vírus é capaz de cruzar a barreira endotelial sem causar danos celulares. Por fim, células gliais e neuronais humanas apresentam intensa resposta à infecção viral, com a liberação de citocinas, quimiocinas e modulação de vias celulares Ver menos

Abstract: Oropouche virus (OROV) is an emerging arbovirus responsible for thousands of cases of exanthematous febrile illness in the Amazon region. As other arboviruses, OROV can cause neurological complications in a portion of infected patients. Although it has been demonstrated that OROV can cross the blood-brain barrier (BBB) ??and cause infection in the central nervous system (CNS) of neonate mice and hamsters, little is known about the pathogenetic mechanisms associated with the breakdown of this barrier. It has already been demonstrated that IRF-5 (Interferon regulatory factor 5), a transcription factor activated after recognition of PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), is essential in controlling the neuroinvasion of OROV and other arboviruses such as WNV and LACV. Therefore, the objective of this project was to characterize the role of IRF-5 expression in endothelial cells in controlling neuroinvasion by OROV and explore the factors associated with viral infection in the CNS. For this, we analyzed mortality, viral tropism and leukocyte infiltration in the CNS of animals that do not express IRF-5 in the endothelium, using the Cre/LoxP recombination system. We also characterized OROV infection and the expression of innate immune response genes and endothelial adhesion factors in established endothelial cell lines. Furthermore, we examined the effect of IRF-5 on the integrity and passage of viruses across the endothelial barrier and through complex models that mimic the BBB. Finally, we used bio-plex and RNA-seq techniques to explore the response of human CNS cells to OROV infection. The results showed that 35% of the conditional knockout animals are vulnerable to infection, showing signs of neurological impairment as loss of balance and limb paralysis, high viral load in the CNS (between 104 and 108 eqFFU/g) and increased number and adhesion of immune cells to the brain microvasculature, even when infection occurs through the transference of circulating infected immune cells. Therefore, we conclude that the expression and activation of IRF-5 in endothelial cells is essential to restrict access to the CNS and the consequent breakdown of the BBB during OROV infection in vivo. Furthermore, OROV productively infects established human (HBEC-5i) and murine (BEND3) endothelial cell lines. While HBEC-5i cells are highly susceptible and permissive to OROV infection, reaching titers as high as 105 and 106 FFU/mL, BEND3 cells are partially resistant to infection reaching a maximun of 104 FFU/mL, with lower extracellular amounts of virus and no apparent cytopathic effect. It was also possible to observe a strong antiviral response in infected endothelial cells, with increased expression of signaling pathways, interferon-stimulated genes (ISGs) and endothelial adhesion factors (ICAM, VCAM, e-selectin and p-selectin). Still, there was no modulation in the expression of tight junctions or disruption of the endothelial barrier in vitro, despite it being possible to recover virus in the lower chamber in transwell models, indicating that the virus is capable of crossing the endothelial barrier without causing cellular damage. Finally, human glial and neuronal cells present an intense response to viral infection, with the release of cytokines, chemokines and modulation of cellular pathways Ver menos