Resumo: As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero "Leishmania" e responsáveis por milhares de novos casos reportados anualmente em todo o mundo. O tratamento das leishmanioses possui limitações, que se estendem desde o alto custo e número limitado de fármacos, até efeitos colaterais muitas vezes graves. O crescente aumento de falha terapêutica, associado a emergência de parasitos resistentes, principalmente aos antimoniais, tem sido responsável pela busca de fármacos alternativos e pela implementação de novos esquemas terapêuticos contra a doença. A paromomicina (PM), um antibiótico aminoglicosídeo de baixo custo aprovado para o tratamento da leishmaniose visceral na África e no Sudeste Asiático, tem demonstrado boa eficácia clínica por monoterapia ou em combinação com a anfotericina B e a miltefosina. Além disso, a PM apresentou atividade in vitro e in vivo contra espécies endêmicas causadoras da leishmaniose tegumentar no Brasil, principalmente L. ("Leishmania") amazonensis, a segunda espécie mais prevalente no país e agente etiológico da leishmaniose cutânea localizada e cutânea difusa. Diante do potencial de utilização da PM no tratamento da leishmaniose tegumentar e dos mecanismos de ação e resistência a esse fármaco ainda não estarem completamente elucidados, neste estudo foram geradas linhagens resistentes à PM de L. (L.) amazonensis selecionadas por métodos distintos, e que juntamente com isolados clínicos altamente suscetíveis à PM desta mesma espécie, foram caracterizados fenotípica e genotipicamente, com o intuito de identificar potenciais genes relacionados com a suscetibilidade e resistência à PM. As linhagens resistentes selecionadas por mutagênese in vitro e pressão seletiva nas formas promastigota e amastigota intracelular do parasito foram consideradas resistentes em ambos os estágios do ciclo de vida do parasito, com exceção da linhagem resistente selecionada por pressão seletiva na forma promastigota, que perdeu a capacidade de infecção no hospedeiro mamífero in vitro e in vivo. A linhagem resistente selecionada na forma amastigota por pressão seletiva, por outro lado, mostrou alta capacidade infectiva in vitro e in vivo, e resposta refratária ao tratamento in vivo com PM. O sequenciamento do genoma completo das linhagens resistentes à PM, assim como dos isolados clínicos altamente suscetíveis ao fármaco, permitiu identificar polimorfismos genéticos que foram validados funcionalmente e associados ao fenótipo de resistência à PM em L. (L.) amazonensis. Os genes identificados codificam proteínas envolvidas no tráfego de vesículas, tradução, metabolismo de lipídeos, e metilação de RNA. A identificação dos mecanismos de ação e resistência à PM pode contribuir para a implementação de esquemas de tratamento mais eficientes, além de rastrear o surgimento e disseminação de cepas do parasito resistentes a este fármaco. Finalmente, este estudo pode contribuir para o desenvolvimento de derivados de aminoglicosídeos mais eficazes para o tratamento da leishmaniose Ver menos

Abstract: Leishmaniasis is a complex of parasitic diseases caused by protozoa of the genus "Leishmania", which are responsible for thousands of new cases reported annually around the world. The treatment of leishmaniasis has limitations, which range from the high cost and limited number of drugs to serious side effects. The increase in therapeutic failure associated with the emergence of resistant parasites, mainly to antimonials, was responsible for the search for alternative drugs and implementation of new therapeutic schemes against the disease. Paromomycin (PM), a low-cost aminoglycoside antibiotic approved for the treatment of visceral leishmaniasis in Africa and Southeast Asia, has demonstrated good clinical efficacy as monotherapy or in combination with amphotericin B and miltefosine. In addition, PM has in vitro and in vivo activity against endemic species that cause tegumentary leishmaniasis in Brazil, including L. ("Leishmania") amazonensis, the second most prevalent species in the country and the etiological agent of localized and diffuse cutaneous leishmaniasis. Given the potential use of PM in the treatment of tegumentary leishmaniasis and the limited knowledge on the mechanisms of action and resistance to this drug, in this study, PM-resistant lines of L. (L.) amazonensis were generated using different methodologies of selection and, with clinical isolates highly susceptible to PM from this same species, were phenotypically and genotypically characterized with the aim of identifying potential genes related to susceptibility and resistance to PM. The resistant lines selected by in vitro mutagenesis and stepwise selection at the promastigote and intracellular amastigote stages were considered resistant in both stages of the parasite, with exception of a resistant line selected by stepwise selection at the promastigote stage, which lost the capacity for in vitro and in vivo infection in the mammalian host. The resistant line selected in the amastigote form by stepwise selection, on the other hand, showed high infective capacity in vitro and in vivo and a refractory response to in vivo treatment with PM. Whole-genome sequencing of PM-resistant lines and clinical isolates highly susceptible to the drug led to the identification of genetic polymorphisms that were functionally validated and associated with the PM resistance phenotype in L. (L.) amazonensis. The genes identified encode proteins involved in vesicle trafficking, translation, lipid metabolism, and RNA methylation. Identification of the mechanisms of action and resistance to PM may contribute to the use and implementation of more efficient treatment regimens, in addition to allowing surveillance of the emergence and dissemination of parasites resistant to this drug. Finally, this study may contribute to the development of more effective aminoglycoside derivatives for the treatment of leishmaniasis Ver menos