Resumo: "Schistosoma mansoni" é o principal parasita responsável pela esquistossomose no Brasil e possui um ciclo de vida complexo com alterações morfológicas durante seu ciclo de vida. O ciclo deste parasita é composto pelos estágios de miracídios, esporocitos I e II, cercárias e vermes adultos. Estas alterações morfológicas entre os estágios são reguladas por modificações pós-traducionais de histonas e co-reguladores transcricionais. Estes co-reguladores juntamente com modificações pós-traducionais (PTMs) são responsáveis por manter ou ativar diferentes estados da cromatina e modificar sua paisagem. Em S. mansoni já foram descritos co-reguladores transcricionais, além de modificações de histonas que estão envolvidas no silenciamento transcricional do estágio cercaria. Dentre os co-reguladores transcricionais conhecidos, a proteína da heterocromatina 1 (HP1) desempenha funções de silenciamento da cromatina a partir de ligações à marcas epigenéticas relacionadas a heterocromatina, H3K9me3 e H3K27me3. As funções de HP1 são bem estabelecidas em diversos organismos e já foi descrita em S. mansoni como uma proteína co-reguladora relacionada à diferenciação sexual e influenciar na taxa de oviposição. Esta proteína foi descoberta em Drosophila e possui avançados neste organismo para HP1, assim, Drosophila é um excelente modelo comparativo para os resultados. O objetivo deste estudo foi verificar o papel de SmHP1 na regulação transcricional nas fases de esporocisto e cercárias em S. mansoni, o estabelecimento da metodologia de RNA interferente para o gene SmHP1 e a influência do silenciamento transiente na oviposição do parasita. A metodologia consistiu em obter bibliotecas de ChIP-seq a partir da técnica de ChIPmentation, estudo in vivo com camundongos infectados com esquistossômulos 3 dias knockdown, imunoprecipitação seguido de espectrometria de massas com extratos de cercarias e western blot do imunoprecipitado para avaliar a ligação de SmHP1 com as marcas epigenéticas H3K9me3 e H3K27me3. Para o experimento de ChIP-seq foi necessário utilizar Drosophila como modelo comparativo, pois não há dados de sequenciamento disponíveis de SmHP1 para S. mansoni, além da necessidade de avaliar a qualidade do anticorpo anti-HP1 (Ab109028). Os nossos resultados possibilitaram mostrar que o enriquecimento da cromatina nos estágios testados, esporocistos e cercarias ocorre de forma não-canônica, ou seja, nas regiões finais no transcrito (transcript end sites – TES) e não na região inicial da transcrição (transcript start sites -TSS), conforme verificado em D. melanogaster, utilizando o mesmo anticorpo. E isso se verifica nos dois estágios do ciclo testados, sugerindo uma tendência a esse tipo de regulação no ciclo de vida do parasita. Os experimentos de knockdown do gene SmHP1 mostraram que, a transcrição desse gene e provavelmente o enriquecimento dessa proteína na cromatina está relacionada ao sistema reprodutor do parasita, visto que uma pequena mudança na expressão do gene SmHP1 foi capaz de aumentar a capacidade de oviposição do parasita, de forma estatisticamente significante, sugerindo uma modificação no fitness do parasita, comparado com os parasitas controles (3 dias esquistossômulo sem o dsRNA (selvagem) e mCherry). Os experimentos realizados envolvendo a imunoprecipitação, utilizando o anticorpo anti-HP1 e a análise9993 por espectrometria de massas, mostraram proteínas candidatas a imunoprecipitarem concomitantemente com HP1 em extratos protéicos de cercarias do parasita. Embora isso aconteça, não foi possível provar que exista uma interação com conhecidas marcas de histonas que desempenham a função de regulação da expressão gênica do parasita Ver menos

Abstract: "Schistosoma mansoni" is the main parasite responsible for schistosomiasis in Brazil and has a complex life cycle with morphological changes during its life cycle. The life cycle of this parasite is composed of the stages of miracidia, sporocytes I and II, cercariae and adult worms. These morphological changes between stages are regulated by post-translational modifications of histones and transcriptional co-regulators. These co-regulators together with post-translational modifications (PTMs) are responsible for maintaining or activating different chromatin states and modifying its landscape. In S. mansoni, transcriptional co-regulators have been described, in addition to histone modifications that are involved in the transcriptional silencing of the cercaria stage. Among the known transcriptional co-regulators, the heterochromatin protein 1 (HP1) plays a role in chromatin silencing by binding to heterochromatin-related epigenetic marks, H3K9me3 and H3K27me3. The functions of HP1 are well established in several organisms and have been described in S. mansoni as a co-regulatory protein related to sexual differentiation and influencing the oviposition rate. This protein was discovered in Drosophila and has advanced expression levels in this organism for HP1, thus Drosophila is an excellent comparative model for the results. The aim of this study was to verify the role of SmHP1 in transcriptional regulation in the sporocyst and cercariae stages in S. mansoni, the establishment of the RNA interference methodology for the SmHP1 gene and the influence of transient silencing on the oviposition of the parasite. The methodology consisted of obtaining ChIP-seq libraries from the ChIPmentation technique, in vivo study with mice infected with 3-day knockdown schistosomula, immunoprecipitation followed by mass spectrometry with cercariae extracts and western blot of the immunoprecipitate to evaluate the binding of SmHP1 to the epigenetic marks H3K9me3 and H3K27me3. For the ChIP-seq experiment, it was necessary to use Drosophila as a comparative model, since there is no sequencing data available for SmHP1 for S. mansoni, in addition to the need to evaluate the quality of the anti-HP1 antibody (Ab109028). Our results showed that chromatin enrichment in the tested stages, sporocysts and cercariae, occurs in a non-canonical manner, i.e., in the final regions of the transcript (transcript end sites - TES) and not in the initial region of transcription (transcript start sites - TSS), as verified in D. melanogaster, using the same antibody. And this is verified in both stages of the cycle tested, suggesting a tendency towards this type of regulation in the parasite's life cycle. The SmHP1 gene knockdown experiments showed that the transcription of this gene and probably the enrichment of this protein in chromatin is related to the parasite's reproductive system, since a small change in the expression of the SmHP1 gene was able to increase the parasite's oviposition capacity, in a statistically significant manner, suggesting a modification in the parasite's fitness, compared to the control parasites (3-day schistosomula without dsRNA (wild-type) and mCherry). Experiments involving immunoprecipitation using the anti-HP1 antibody and mass spectrometry analysis showed candidate proteins to immunoprecipitate concomitantly with HP1 in protein extracts of parasite cercariae. Although this occurs, it was not possible to prove that there is an interaction with known histone marks that play the role of regulating parasite gene expression Ver menos