Investigação in vivo dos efeitos da hemólise aguda e crônica na formação de inflamassomas
Pâmela Lara de Brito
TESE
Português
T/UNICAMP B777i
[In vivo investigation of the effects of acute and chronic hemolysis on the formation of inflammasomes ]
Campinas, SP : [s.n.], 2024.
1 recurso online (213 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: A hemólise intravascular, ou seja, a destruição das hemácias na circulação, está presente em diversas condições, como na anemia falciforme, pré-eclâmpsia e infecções. O rompimento das hemácias resulta na liberação de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs), como hemoglobina (Hb) e...
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Resumo: A hemólise intravascular, ou seja, a destruição das hemácias na circulação, está presente em diversas condições, como na anemia falciforme, pré-eclâmpsia e infecções. O rompimento das hemácias resulta na liberação de padrões moleculares associados ao dano (DAMPs), como hemoglobina (Hb) e heme, capazes de induzir o processo inflamatório estéril. Estudos indicam a participação do inflamassoma NLRP3 na resposta inflamatória ao heme e a outros DAMPs, no qual o inflamassoma processa a citocina IL-1?, contribuindo assim para a ativação e morte celular. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos in vivo da hemólise intravascular aguda e crônica, e a participação da formação de inflamassomas e ativação de caspase-1 nestes mecanismos, visando aprimorar a compreensão da fisiopatologia de doenças em que ocorrem hemólise intravascular. No decorrer do estudo, utilizamos dois modelos murinos para simular a hemólise intravascular: um de caráter agudo, provocado por estresse osmótico (HEM), e outro de natureza crônica, desencadeado por repetidas baixas doses de fenilhidrazina (HEM Crônica). Em adição, ensaios in vitro foram realizados para avaliar a resposta de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVECs) aos estímulos de heme e da alarmina S100A8. Os dados coletados mostram que a indução de hemólise aguda eleva de forma imediata e significativa as concentrações de Hb e heme livres no plasma dos camundongos. A haptoglobina (Hp), uma proteína de remoção de hemoglobina, foi reduzida dentro das primeiras 3 horas, indicando seu rápido consumo, e a hemopexina (Hx), uma proteína de remoção de heme, teve tendência de redução após 3 horas. Os níveis plasmáticos tanto de Hp quanto Hx foram restaurados no período de 6 horas após a hemólise intravascular. Camundongos HEM apresentaram aumento significativo de leucócitos, especialmente granulócitos e monócitos, em 1 hora e 3 horas, associados a liberação das citocinas pró-inflamatórias TNF-?, IL-6, IL-1? e IL-18, além da S100A8. A hemólise intravascular aguda também induziu o aumento de monócitos (Ly6ChiCD43+) e neutrófilos (Ly6GhiCD11+) periféricos com caspase-1 ativada (FLICA+). Análise de microscopia intravital na microvasculatura do cremaster mostrou aumento de leucócitos em rolamento, aderidos e extravasados após estímulo de hemólise intravascular aguda, associado à diminuição significativa da perfusão e da velocidade do fluxo sanguíneo microvascular da pele nos camundongos HEM. A inibição do inflamassoma NLRP3 pela molécula MCC950 reduziu a contagem de monócitos e neutrófilos com caspase-1 ativada, diminuiu leucócitos em rolamento e aderidos à parede dos vasos, e reverteu a diminuição da perfusão da microvasculatura. A inibição seletiva da caspase-1 com YVAD também resultou na melhora do fluxo sanguíneo e na redução do recrutamento de leucócitos à parede vascular. Nenhum dos tratamentos resultaram na diminuição significativa da liberação de TNF-? ou de IL-1? nos animais HEM. Animais em HEM Crônica apresentaram depleção significativa de Hx a partir do 14º dia, indicando uma remoção constante dessa proteína neutralizante de heme. Houve um aumento significativo nos níveis de IL-1? e IL-18 no plasma de camundongos HEM Crônica, juntamente com aumento de monócitos e neutrófilos periféricos com caspase-1 ativada. A avaliação de macrófagos no tecido hepático indicou um aumento na população de macrófagos (F4/80+CD11b+) e de macrófagos residentes do tecido hepático (F4/80+CD11b+CD206-/+) com caspase-1 ativada. Análises da expressão proteica do fígado de camundongos HEM Crônica revelaram um aumento significativo da expressão do sensor NLRP3, e reduções das expressões de subunidades inativada e clivadas (subunidades p15 e p20) de capase-1, sem alterações na expressão de IL-1? imatura ou clivada. Por fim, com intuito de entender melhor o papel do endotélio no processamento de IL-1 ? induzido por hemólise, experimentos feitos in vitro com células endoteliais HUVECs confirmaram que o heme induz o aumento da expressão das moléculas de adesão ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina, e liberação de IL-1?, IL-8 e MCP1, em associação com a indução da atividade de caspase-1. Além disso, a incubação das células HUVEC com heme resultou no aumento da expressão gênica de CASP1, sem afetar a expressão de RNAm de NLRP3, PYCARD, IL1B e IL18. Demostramos, de forma inédita, que o heme provoca a liberação da alarmina S100A8 pelas HUVECs. Surpreendentemente, essa alarmina, quando incubada isoladamente com as HUVEC, induziu a ativação dessas células, com aumento na produção de IL-1?, IL-6 e MCP-1, no entanto, S100A8 não afetou a expressão das moléculas de adesão. Ao investigarmos a resposta das células endoteliais na presença de S100A8 seguida de heme, constatamos que a S100A8 potencializou os efeitos de heme na liberação de citocinas e na expressão genica de CASP1 e PYCARD, sem afetar a expressão gênica de NLRP3, IL1B ou IL18. Em conclusão, esses resultados sugerem que tanto o inflamassoma NLRP3 quanto a atividade de caspase-1 contribuem para a inflamação vascular estéril desencadeada pela hemólise intravascular. Destaca-se que a atividade de caspase-1, e não necessariamente a citocina IL-1?, desempenha um papel significativo no recrutamento de leucócitos e na hipoperfusão que ocorrem subsequente à hemólise, indicando a caspase-1 como um potencial alvo terapêutico para atenuar os efeitos adversos decorrentes dos processos de hemólise intravascular
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Abstract: Intravascular hemolysis, or the destruction of red blood cells in the circulation, occurs in various conditions, including sickle cell anemia, pre-eclampsia, and infections. The rupture of red blood cells results in the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs), in particular...
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Abstract: Intravascular hemolysis, or the destruction of red blood cells in the circulation, occurs in various conditions, including sickle cell anemia, pre-eclampsia, and infections. The rupture of red blood cells results in the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs), in particular hemoglobin (Hb) and heme, which are capable of inducing sterile inflammatory processes. Studies have highlighted the involvement of the NLRP3 inflammasome in the inflammatory response to heme and other DAMPs, where the processing and release of the cytokine, IL-1?, contributes to cell activation and cell death. The aim of this study was to investigate the in vivo effects of acute and chronic intravascular hemolysis, and the role that inflammasome formation and caspase-1 activation plays in these responses, aiming to better understand the pathophysiology of diseases characterized by hemolytic inflammation. For the study, we employed two murine models to simulate intravascular hemolysis: one acute model induced by osmotic stress (HEM) and another chronic model triggered by repeated low doses of phenylhydrazine (Chronic HEM). Additionally, in vitro assays were conducted to assess the response of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) to heme and S100A8 stimuli. The data obtained showed that induction of acute hemolysis led to an immediate and significant increase in plasma free Hb and heme levels in HEM mice. Haptoglobin (Hp), a hemoglobin scavenging protein, was reduced within the first 3 hours, indicating rapid consumption, while hemopexin (Hx), a heme scavenging protein, showed a trend towards a decrease at 3 hours after hemolysis. The plasma levels of both Hp and Hx returned to basal levels at 6 hours at intravascular hemolysis. HEM mice exhibited a significant increase in leukocytes, especially granulocytes and monocytes, at 1 and 3 hours, associated with the release of pro-inflammatory cytokines TNF-?, IL-6, IL-1?, IL-18, and S100A8. Acute intravascular hemolysis also induced an increase in peripheral monocytes (Ly6ChiCD43+) and neutrophils (Ly6GhiCD11+) with activated caspase-1 (FLICA+). Intravital microscopy analysis of the cremaster microvasculature showed an increase in rolling, adherent, and extravasated leukocytes after acute intravascular hemolysis stimulus, associated with a significant reduction in microvascular perfusion and blood flow velocity in the skin of HEM mice. Pre-administration of the NLRP3 inflammasome inhibitor, MCC950, to HEM mice reduced the activation of caspase-1 monocytes and neutrophils, decreased microvascular leukocyte recruitment, and reversed the decrease in microvascular perfusion. Selective caspase-1 inhibition with YVAD in HEM mice also improved blood flow and reduced recruitment of leukocytes to the vessel wall. Neither MCC950 nor YVAD had significant effects on TNF-? or IL-1? release in HEM animals. Chronic HEM mice displayed significant depletion of Hx from the 14th day, indicating permanent removal of this heme-neutralizing protein. There was a significant increase in IL-1? and IL-18 levels in the plasma of Chronic HEM mice, along with an increase in peripheral monocytes and neutrophils with activated caspase-1. Evaluation of macrophages in the hepatic tissue indicated an increase in the population of macrophages (F4/80+CD11b+) and resident hepatic tissue macrophages (F4/80+CD11b+CD206-/+) with activated caspase-1. Protein expression analyses in the liver of Chronic HEM mice revealed a significant increase in NLRP3 protein expression, reductions in inactive (pro-caspase-1) and cleaved caspase-1 subunit (p15 and p20) expressions, with no changes in immature or cleaved IL-1?. Finally, with the aim of investigating the role of the endothelium in hemolytic inflammation, in in vitro experiments with HUVECs confirmed that incubation of the cells with heme induces an increased expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin, induction of caspase-1 activity, and the release of IL-1?, IL-8, and MCP1. Furthermore, heme incubation resulted in an increase in CASP1 gene expression without affecting the mRNA expressions of NLRP3, PYCARD, IL1B, and IL18 in HUVECs. In a novel finding, we demonstrated that heme provoked the release of the S100A8 alarmin by HUVECs. Surprisingly, this alarmin when incubated with HUVEC alone induced the activation of these cells, as indicated by an increase in the production of IL-1?, IL-6, and MCP1; however, S100A8 did not affect the expression of adhesion molecules. When investigating the response of endothelial cells in the presence of S100A8 followed by heme, we found that S100A8 potentiated the effects of heme on cytokine release and the gene expression of CASP1 and PYCARD, without affecting the gene expression of NLRP3, IL1B, or IL18. In conclusion, these results suggest that both NLRP3 inflammasome and caspase-1 activity contribute to the sterile vascular inflammation triggered by intravascular hemolysis. Notably, caspase-1 activity, rather than necessarily cytokine IL-1?, plays a significant role in the leukocyte recruitment and subsequent hypoperfusion that occurs following hemolysis, indicating caspase-1 as a potential therapeutic target to mitigate the adverse effects arising from hemolytic processes
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Aberto
Zorzetto, Nicola Amanda Conran, 1972-
Orientador
Traina, Fabíola
Avaliador
Maio, Karina Tozatto
Avaliador
Saad, Sara Teresinha Olalla, 1956-
Avaliador
Costa, Renata Sesti
Avaliador
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Pâmela Lara de Brito
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