Resumo: O adenoma pleomórfico (AP) é propenso a alterações genéticas que levam à sua contraparte maligna, o carcinoma ex-adenoma pleomórfico (CXAP), um tumor raro e agressivo com comportamento e prognóstico distintos. Utilizando o sequenciamento completo do exoma (WES), examinamos o DNA de 7 pacientes com AP, 13 com CXAP e 5 com AP residual. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram identificadas em todas as amostras, filtradas com uma frequência alélica de doença na população (AF) ?0,2, e esses resultados foram validados por imunofluorescência. Identificamos 823 genes com mutações não sinônimas, sendo 30,5% exclusivos para AP, 28,7% para AP residual e 18,3% para CXAP. Notavelmente, 12,6% desses genes apresentavam mutações persistentes do AP para o CXAP, enquanto 7,9% exibiam mutações ao longo da sequência adenoma-carcinoma. Os alvos-chave incluíram genes relacionados à matriz extracelular (MEC) (especialmente TNXB), genes supressores de tumor conhecidos (PCDH9, LRMP, KDM5A, RB1, TP53), e oncogenes cruciais (USP4, MUC4, BRAF, GNAS) em importantes vias do câncer, incluindo a mutação pontual do gene MYB nos três grupos analisados. A análise de imunofluorescência revelou expressão de c-Myb em todos os grupos, com redução ao longo da sequência adenoma-carcinoma, refletindo o impacto de alterações no número de cópias (CNAs) na perda deste gene ao longo da sequência adenoma-carcinoma. Esses achados foram corroborados pela análise de 27 casos de CXAP e 14 amostras de AP residual pareadas, utilizando hibridização genômica comparativa baseada em array (aCGH). Além disso, nossos resultados do aCGH, evidenciaram a persistência do ganho cromossômico de PLAG1 tanto no AP residual quanto no CXAP. Amplificações de HMGA2 e RPSAP52 foram prevalentes, enquanto a amplificação de GRB7 pode representar um passo inicial na transformação maligna de AP para CXAP. Os genes amplificados em áreas transformadas do tumor foram enriquecidos para processos biológicos relacionados à sinalização imunológica (como genes da família INF-?). Em relação ao shift metabólico adquirido na transformação maligna do AP, observamos que FASN e GLUT-1 apresentam alterações nos tumores malignos, conforme evidenciado por diferentes metodologias. Além disso, no desenvolvimento do CXAP, a célula mioepitelial parece desempenhar um papel de destaque em vários processos e interações, apesar de ter um papel ambíguo na literatura. Nossos achados do WES apontam mutações em diferentes genes e vias que podem estar relacionados a célula mioepitelial, especialmente utilizando-se da MEC como palco de fundo para alterações no microambiente tumoral. Por fim, é crucial notar que as alterações genéticas encontradas em CXAP já estavam presentes na área benigna residual adjacente à área de transformação. Em resumo, este estudo lança luz sobre a intrincada coreografia de mutações pontuais e cromossômicas que ocorrem simultaneamente em oncogenes e genes supressores de tumor para orquestrar a transformação do AP em CXAP, com a célula mioepitelial sendo um possível alvo de mutações neste processo. Nossos resultados enfatizam também a presença precoce de alterações genéticas cruciais na área benigna residual, que, embora apresente características morfológicas de um AP convencional, exibe uma assinatura molecular pré-maligna Ver menos

Abstract: Pleomorphic adenoma (PA) is susceptible to genetic alterations that can result in its malignant counterpart, carcinoma ex-pleomorphic adenoma (CXPA), which is a rare and aggressive tumor with distinct behavior and prognosis. We used whole exome sequencing (WES) to analyze the DNA of 7 patients with PA, 13 with CXPA, and 5 with residual PA. All samples were analyzed for single nucleotide polymorphisms (SNPs) and filtered based on a population disease allele frequency (AF) ?0.2. The results were validated using immunofluorescence. A total of 823 genes with non-synonymous mutations were identified, with 30.5% exclusive to PA, 28.7% to residual PA, and 18.3% to CXPA. Notably, 12.6% of these genes showed persistent mutations from PA to CXPA, while 7.9% showed mutations along the adenoma-carcinoma sequence. The study focused on various genes, including extracellular matrix (ECM)- related genes such as TNXB, tumor suppressor genes like PCDH9, LRMP, KDM5A, RB1, TP53, and key oncogenes such as USP4, MUC4, BRAF, GNAS. These genes are involved in important cancer pathways, including the MYB gene point mutation in all three groups analyzed. Immunofluorescence analysis showed c-Myb expression in all groups, with a decrease along the adenoma- carcinoma sequence, reflecting the impact of copy number alterations (CNAs) in the loss of this gene along the adenoma-carcinoma sequence. These findings were confirmed by analyzing 27 CXPA cases and 14 matched residual PA samples using array-based comparative genomic hybridization (aCGH). Additionally, our aCGH results demonstrate the persistence of PLAG1 chromosomal gain in both residual PA and CXPA. Amplification of HMGA2 and RPSAP52 was prevalent, while GRB7 amplification may represent an initial step in malignant transformation from PA to CXPA. The genes that were amplified in the tumor-transformed areas were enriched for biological processes related to immune signaling, such as INF-? family genes. In the context of the malignant transformation of PA, we observed alterations in FASN and GLUT-1 in malignant tumors, as evidenced by different methodologies. Additionally, the myoepithelial cell appears to play a prominent role in CXPA development through various processes and interactions, although its role is unclear in the literature. Our WES analysis indicates that mutations in different genes and pathways may be linked to myoepithelial cells, especially in the context of changes in the tumor microenvironment with reference to the ECM. It is important to note that the genetic alterations identified in CXPA were already present in the adjacent benign residual area adjacent to the transformation area. In summary, this study illuminates the complex interplay between point mutations and chromosomal alterations that occur concurrently in oncogenes and tumor suppressor genes to facilitate the transformation from PA to CXPA. Our results also highlight the early presence of crucial genetic alterations in the residual benign area, which, although displaying morphological characteristics of a conventional PA, exhibits a pre-malignant molecular signature Ver menos