Characterization of CsLIEXP1 as a new susceptibility gene to "Xanthomonas citri" subsp. citri and gene editing by CRISPR/Cas9 for citrus canker tolerance [recurso eletrônico]
Reinaldo Rodrigues de Souza Neto
TESE
Inglês
T/UNICAMP So89c
[Caracterização de CsLIEXP1 como um novo gene de susceptibilidade a "Xanthomonas citri" subsp. citri e edição gênica por CRISPR/Cas9 para tolerância ao cancro cítrico]
Campinas, SP : [s.n.], 2022.
1 recurso online (78 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Alessandra Alves de Souza
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Cancro cítrico é uma doença causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A patogenicidade dessa bactéria é dependente da translocação de proteínas efetoras chamadas Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) para dentro da célula hospedeira. Essas proteínas funcionam como fatores de...
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Resumo: Cancro cítrico é uma doença causada por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A patogenicidade dessa bactéria é dependente da translocação de proteínas efetoras chamadas Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) para dentro da célula hospedeira. Essas proteínas funcionam como fatores de transcrição nas plantas, promovendo a expressão de genes de susceptibilidade a doença. Em Xcc, o PthA4 é o principal TALE, essencial para regulação de genes do hospedeiro que vão facilitar a colonização da bactéria. Esse efetor transativa o gene CsLOB1, o qual é um fator de transcrição cuja expressão está associada ao desenvolvimento dos sintomas. Embora CsLOB1 seja necessário para a indução de cancro em diferentes espécies de Citrus, outros genes podem também estar envolvidos no desenvolvimento do cancro. Desta forma, o objetivo desse estudo foi identificar novos genes de susceptibilidade de laranja doce a Xcc e usar a tecnologia CRISPR/Cas9 para edição e comprovação da funcionalidade do gene no desenvolvimento do cancro cítrico. Portanto, baseado em dados de transcriptoma, sete genes candidatos a serem regulados por PthA4 foram identificados e validados por expressão relativa. Entre eles, os genes CsLOB1 e uma expansina mostraram os mais altos níveis de expressão em todas as variedades em resposta a infecção com Xcc, mas não para Xcc-?pthA4. Em ensaios de agroinfiltração, o gene expansina não foi regulado por PthA4, mas foi induzido por CsLOB1, o qual foi induzido por PthA4, indicando que o gene expansina é indiretamente regulada por PthA4. Portanto, esse gene foi renomeado para CsLOB1-INDUCED EXPANSIN 1 (CsLIEXP1) Assim, o gene CsLIEXP1 foi caracterizado como um gene de susceptibilidade indiretamente induzido por PthA4. Para comprovar seu papel no desenvolvimento do cancro cítrico, um vetor CRISPR/Cas9 foi desenvolvido com 3 sgRNA visando a edição do primeiro exon do gene CsLIEXP1. Vinte e duas linhagens transgênicas foram obtidas, e uma foi selecionada por High Resolution Melting Analysis (HRMA) como planta possivelmente editada, o que foi comprovado por sequenciamento genético. A linhagem H_CsLIEXP1_1 apresentou edição de 6,25% de cinco nucleotídeos e 37,5% de uma timina, sendo no total de 43,75% de edição. Esta planta foi desafiada com Xcc e afetou o crescimento bacteriano e desenvolvimento de sintomas. Dessa forma, foi demonstrado que a edição do gene CsLIEXP1 interferiu no desenvolvimento dos sintomas de cancro cítrico e, consequentemente, afetou o crescimento bacteriana. Portanto, nesse estudo, um novo gene de susceptibilidade foi identificado e usando a abordagem de edição de genoma foi obtida planta mais tolerante ao cancro cítrico
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Abstract: Citrus canker is a disease caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The pathogenicity of this bacterium is dependent on the translocation of effector proteins called Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into the host cell. These proteins work as transcription factors in...
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Abstract: Citrus canker is a disease caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). The pathogenicity of this bacterium is dependent on the translocation of effector proteins called Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into the host cell. These proteins work as transcription factors in plants, promoting disease susceptibility genes expression. In Xcc, PthA4 is the main TALE essential for host gene regulation which will facilitate the bacterial colonization. This effector transactivates the CsLOB1 gene, which one is a transcription factor, whose expression is associated with symptoms development. Although CsLOB1 is required to induce canker on different species of Citrus, may other genes could be also involved in canker development. Thus, the goal of this study was to identify new susceptibility genes of sweet orange to Xcc and using CRISPR/Cas9 technology for editing and confirming of functionality in citrus canker development. Therefore, based on transcriptomic data, seven candidate genes to be regulated by PthA4 were identified and validated by relative expression. Among them, an expansin and CsLOB1 genes showed the highest expression levels in all varieties in response to Xcc, but not Xcc-?pthA4 infection. In agroinfiltration assay, the expansin gene was not regulated by PthA4, but it was induced by CsLOB1, which one was induced by PthA4, thus, expansin is indirectly regulated by PthA4. Therefore, this gene was renamed for CsLOB1-INDUCED EXPANSIN 1 (CsLIEXP1). So, the CsLIEXP1 gene was characterized as a susceptibility gene indirectly induced by PthA4. To confirm its role in citrus canker development, a CRISPR-Cas9 vector was developed with 3 sgRNA targeting the editing of first exon of CsLIEXP1 gene. Twnety-two transgenic lines were obtained, and one was selected by High Resolution Melting Analysis (HRMA) as putative edited plant, which was confirmed by genetic sequencing. The. H_CsLIEXP1_1 line presented editing of 6.25% of five nucleotides and 37.5% of one thymine, in total of 43.75% of editing. This plant was challenged with Xcc and the bacterial growth was affected as well as symptoms development. Thus, we demonstrated that editing of CsLIEXP1 gene interfered in citrus canker development, and consequently, affected the bacterial growth. Therefore, in this study, a new susceptibility gene was identified and using genome editing approach citrus canker tolerant plant was obtained
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Aberto
Souza, Alessandra Alves de, 1970-
Orientador
Menossi, Marcelo, 1968-
Avaliador
Marques-Souza, Henrique, 1977-
Avaliador
Andrade, Maxuel de Oliveira
Avaliador
Van Sluys, Marie-Anne
Avaliador
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Reinaldo Rodrigues de Souza Neto
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Reinaldo Rodrigues de Souza Neto