Resumo: A substituição de órgãos e tecidos danificados, doentes ou não funcionais por meio da engenharia tecidual é ainda um grande desafio. Dentro desse contexto, avanços recentes na manufatura aditiva têm permitido a fabricação tridimensional de construtos biocompatíveis associadas a células e moléculas bioativas. Com o processo de bioimpressão 3D é potencialmente possível produzir tecidos em uma variedade de formatos, com técnicas reprodutíveis e controláveis. Os processos de bioimpressão de extrusão com biotintas carregados com esferoides celulares usam agregados de células esféricos uniformes como blocos de construção para fabricar tecidos. A maturação do tecido é mais avançada neste caso em comparação com células isoladas em suspensão, porque uma concentração muito maior de células é cultivada em contato próximo por um período prolongado. Avaliar esta abordagem para obter tecido de cartilagem maduro é de grande interesse, uma vez que a diferenciação condrogênica ocorre mais intensamente em agregados do que na cultura de células individuais. Ademais, o tecido cartilaginoso apresenta baixa capacidade de auto reparação e as lesões progridem para o desenvolvimento de diversas condições patológicas de maneira irreversível. Neste cenário, a presente tese teve como objetivo geral a obtenção de construtos de cartilagem por meio da bioimpressão 3D, utilizando biotintas carregadas com esferoides. Para tal, desenvolveu-se um método reprodutível para a obtenção de esferoides uniformes a partir do cultivo de células estromais mesenquimais, baseado na técnica dos micromoldes não adesivos produzidos por impressão 3D. Em seguida, desenvolveu-se um hidrogel natural composto de goma xantana (3.75 % w/v) e alginato (1.12% w/v) para permitir a incorporação eficiente dos esferoides. Os esferoides foram incorporados ao hidrogel, obtendo-se uma biotinta não citotóxica e suficientemente estável. Na sequência, foi otimizado um conjunto de parâmetros para implementar o processo de bioimpressão por extrusão de alto rendimento para a obtenção de um grande número de construtos bioimpressos. Os parâmetros de bioimpressão considerados ótimos foram: superfície seca; 50 kPa de pressão de extrusão; 60 mm/s de velocidade de extrusão; bico cônico de 250 ?m de diâmetro interno; concentração de esferoides de 2,500 por mL de hidrogel (7.6 × 106 células/mL) e reticulação iônica com solução aquosa de CaCl2 (125 mM, 10 minutos). Após a bioimpressão, os construtos foram submetidos a um processo de diferenciação condrogênica pós-bioimpressão e um painel biológico de moléculas foi analisado. Os construtos biológicos apresentaram produção abundante de ECM, com aumento de expressão de colágeno tipos II e IV, com nível mantido de expressão de colágeno X até 28 dias, demonstrando uma diferenciação condrogênica de caráter hialino. Movimentos de migração e processo de fusão de esferoides dispersos no hidrogel foram identificados, e os construtos se mantiveram viáveis e estáveis após um processo de maturação de 56 dias. Por fim, o dispositivo de produção de esferoides se mostrou viável e de custo competitivo para produzir bateladas de esferoides variando de 100, 1000 e 5000 unidades, em um laboratório de cultura celular para uso de caráter acadêmico ou companhias de pequeno porte. No geral, esses resultados mostram o potencial de uma abordagem eficaz para obter construtos baseados em esferoides para serem aplicados na biofabricação de tecido de cartilagem, bem como no estudo de modelos de doença da cartilagem, como a osteoartrite Ver menos

Abstract: The replacement of damaged, diseased or non-functional organs and tissues through tissue engineering is still a challenge. Within this context, recent advances in additive manufacturing have allowed the development of approaches such as the three-dimensional manufacture of biocompatible constructs associated with cells and bioactive molecules. Using the 3D bioprinting process it is potentially possible to produce tissue in a variety of formats, through reproducible and controllable techniques. Extrusion bioprinting processes with spheroid-loaded bioinks use uniform spherical cell aggregates as building blocks to manufacture tissue constructs. Tissue maturation is more advanced in this case if compared to single cells in suspension, because a much higher cell density is cultured in close contact for an extended period. Evaluating this approach to obtain mature cartilage tissue is of great interest, since chondrogenic differentiation occurs more intensively in aggregates than in single cell cultures. Furthermore, the cartilaginous tissue has low self-repair capacity and the lesions often progress to the development of various pathological conditions in an irreversible way. In this scenario, the present thesis aimed at obtaining cartilage constructs through 3D bioprinting, using spheroid-loaded bioinks. To this end, a reproducible method was developed to obtain uniform spheroids culturing mesenchymal stromal cells, based on the technique of non-adhesive micromolds produced by 3D printing. Subsequently, a natural hydrogel composed of xanthan gum (3.75 % w/v) and alginate (1.12 % w/v) was developed to allow efficient incorporation of the spheroids. The spheroids were mixed with the hydrogel, resulting in a non-cytotoxic and sufficiently stable bioink. Then, a set of parameters was optimized to implement a high-performance extrusion bioprinting process to obtain a large number of bioprinted constructs. The bioprinting conditions considered optimum were: dry surface; 50 kPa of extrusion pressure; 60 mm/s of extrusion speed rate; a conic nozzle with 250 ?m of internal diameter, a concentration of 2,500 spheroids/mL hydrogel (7.6 × 106 cells/mL) and ionic crosslinking with CaCl2 solution (125 mM, 10 minutes). After bioprinting, the constructs were submitted to a post-printing chondrogenic differentiation process and a biological panel of molecules was analyzed. The biologic constructs showed abundant ECM production with enhanced collagen type II and type IV secretion and maintained collagen type X levels up to 28 days, thus demonstrating a hyaline-like chondrogenic differentiation behavior. Migration movements and fusion process of spheroids dispersed in the hydrogel were identified, and the constructs were viable and stable after a 56-day tissue maturation process. Finally, the cell spheroid production device showed to be feasible and cost-competitive to produce batches of 100, 1000, and 5000 spheroids in a cell culture laboratory, either for academic use or for small-scale companies. Overall, these results show the potential of an effective approach to obtain spheroid-loaded constructs to be applied in the biofabrication of cartilage tissue, as well as in the study of models of cartilage disease, such as osteoarthritis Ver menos