Resumo: Salmonella enterica Typhimurium é a bactéria mais promissora para o tratamento do câncer e pode ser usada como vetor para a entrega de genes antitumorais. Por sua vez, as OMVs são consideradas mais seguras que as bactérias atenuadas, podem estimular o sistema imunológico e também podem ser usadas como nanocarregadores de agentes antitumorais. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antitumoral de novos mutantes atenuados de S. enterica Typhimurium e OMVs carregadas de violaceína in vitro e in vivo. Assim, três vertentes foram exploradas. Em uma primeira abordagem, uma linhagem atenuada com lise retardada foi utilizada para entregar o gene antitumoral p53 em células de câncer de bexiga humana. A cepa utilizada confere contenção biológica para que as bactérias não persistam in vivo ou sobrevivam no caso de serem excretadas. A Expressão do gene p53 entregue por S. enterica Typhimurium foi verificada por western blot. Demonstramos por ensaio de Calceína AM que p53 entregue por S. enterica Typhimurium diminuiu significativamente a viabilidade de células de câncer de bexiga de uma maneira dependente da dose (entre o 14-82%). Na segunda abordagem, foram construídos os mutantes deltaolRA e deltaihfABpmi utilizando o sistema de recombinação lambda red. Os mutantes construídos demonstraram ser atenuados e conseguem invadir e se replicar em células de câncer de bexiga e melanoma. O tratamento com deltaihfABpmi levou a redução completa da massa tumoral, indução da polarização de macrófagos a o fenótipo M1 e ao incremento significativo da expressão de mediadores pro inflamatórios. Finalmente, na terceira abordagem, o potencial antimelanoma de OMVs carregadas e não carregadas de violaceína foi avaliado. As OMVs foram isoladas a partir de mutante hipervesiculado e sua linhagem parental; A caracterização das OMVs por NTA mostrou que o mutante hipervesiculado produz maior quantidade de OMVs. Análises de HPLC e fluorescência demonstraram que as OMVs podem carregar violaceína. Por fluorescência também demonstramos que OMVs podem entregar violaceína no citoplasma de células tumorais. O tratamento com OMVs carregadas de violaceína levou a redução completa da massa tumoral. Adicionalmente demonstramos que OMVs podem reprogramam o microambiente tumoral pela indução da infiltração de macrófagos, polarização de macrófagos ao fenótipo M1 e produção de mediadores pro-inflamatórios. Os resultados obtidos sugerem que mutantes atenuados de S. enterica Typhimurium e OMVs são uma estratégia promissória para o tratamento do câncer Ver menos

Abstract: Salmonella enterica Typhimurium is the most promising bacterium for cancer treatment and can be used as a vector for the delivery of antitumor genes. For their part, OMVs are considered safer than attenuated bacteria, can stimulate the immune system and can also be used as nanocarriers for antitumor agents. The aim of this study was to evaluate the antitumor effect of new attenuated mutants of S. enterica Typhimurium and violacein-loaded OMVs in vitro and in vivo. Thus, three aspects were explored. In a first approach, an attenuated strain with delayed lysis was used to deliver the p53 antitumor gene into human bladder cancer cells. The strain used provides biological containment so that the bacteria do not persist in vivo or survive in case they are excreted. Expression of the p53 gene delivered by S. enterica Typhimurium was verified by western blot. We demonstrated by Calcein AM assay that p53 delivered by S. enterica Typhimurium significantly decreased bladder cancer cell viability in a dose-dependent manner (between 14-82%). In the second approach, mutants deltatolRA and deltaihfABpmi were constructed using the lambda red recombination system. The constructed mutants were shown to be attenuated and able to invade and replicate in bladder cancer and melanoma cells. Treatment with deltaihfABpmi led to a complete reduction in tumor mass, induction of macrophage polarization to the M1 phenotype and a significant increase in the expression of pro-inflammatory mediators. Finally, in the third approach, the antimelanoma potential of violacein loaded and unloaded OMVs was evaluated. OMVs were isolated from hypervesiculated mutant and its parental lineage; The characterization of OMVs by NTA showed that the hypervesiculated mutant produces a greater amount of OMVs. HPLC and fluorescence analysis demonstrated that OMVs can carry violacein. By fluorescence we also demonstrated that OMVs can deliver violacein into the cytoplasm of tumor cells. Treatment with violacein-loaded OMVs led to complete reduction of tumor mass. Additionally, we demonstrate that OMVs can reprogram the tumor microenvironment by inducing macrophage infiltration, polarizing macrophages to the M1 phenotype and producing pro-inflammatory mediators. The results obtained suggest that attenuated mutants of S. enterica Typhimurium and OMVs are a promising strategy for the treatment of cancer Ver menos