Resumo: As tecnologias de biologia molecular possibilitam a produção de proteínas recombinantes, que são amplamente utilizadas em pesquisa e também exploradas para a produção de insumos e fármacos pela indústria. A metodologia para geração de uma proteína recombinante consiste em veicular um cassete de expressão gênica para uma célula-alvo, que então poderá produzir a proteína de interesse. O sistema de expressão em cultura de células de inseto se baseia na construção de um vetor baculoviral, que contém o cassete de expressão codificando a proteína de interesse. Esse vetor infecta células em cultura que passarão a produzir a proteína recombinante, a qual poderá ser purificada. O sistema baculoviral pode ser utilizado para produção de proteínas que necessitam de modificações pós-traducionais, com um custo inferior e maior rendimento que utilizando-se um sistema de produção em células de mamífero. Neste projeto, descrevemos a construção e caracterização de uma proteína quimérica recombinante contendo um domínio do receptor CD4 humano fusionado à proteína repórter GFP. Essa proteína recombinante, denominada CD4-GFP, foi gerada por meio de um sistema baculoviral em cultura de células de inseto. Otimizamos as condições de produção e purificação da proteína, obtendo-a com pureza relativa de 80%, e recuperação total do processo de 6,3%. A proteína CD4-GFP teve seus domínios funcionais caracterizados, e demonstrado funcionais. Ensaios funcionais em cultura de células demonstraram a seletividade da proteína pelo alvo molecular GP120, o qual é expresso na superfície de células infectadas pelo vírus da imunodeficiência humana. Sendo assim, a proteína quimérica CD4-GFP demonstrou um potencial para uso como uma ferramenta para o desenvolvimento de ensaios diagnósticos e pesquisa de novos fármacos antivirais que atuem na interação viral com a célula-alvo Ver menos

Abstract: Molecular biology technologies enable the production of recombinant proteins, which are widely used in research and also explored for the production of inputs and drugs by the industry. The methodology for generating a recombinant protein consists of delivering a gene expression cassette to a target cell, which can then produce the protein of interest. The insect cell culture expression system is based on the construction of a baculoviral vector, which contains the expression cassette encoding the protein of interest. This vector infects cells in culture that will produce the recombinant protein, which can then be purified. The baculoviral system can be used for the production of proteins that need post-translational modifications, with a lower cost and higher yield than using a production system in mammalian cells. In this project, we describe the construction and characterization of a recombinant chimeric protein containing a human CD4 receptor domain fused to the GFP reporter protein. This recombinant protein, called CD4-GFP, was generated using a baculoviral system in insect cell culture. We optimized the production and purification conditions of the protein, obtaining it with a relative purity of 80%, and a total recovery of the process of 6.3%. The CD4-GFP protein had its functional domains characterized, and demonstrated to be functional. Functional assays in cell culture demonstrated the protein's selectivity for the molecular target GP120, which is expressed on the surface of cells infected by the human immunodeficiency virus. Thus, the CD4-GFP chimeric protein demonstrated a potential for use as a tool for the development of diagnostic assays and research of new antiviral drugs that act on the viral interaction with the target cell Ver menos