Resumo: O ácido valpróico é um ácido graxo de cadeia curta que, associado ao seu sal sódico (VPA), vem sendo utilizado no tratamento de diversos tipos de doenças neurológicas. Sua atuação se estende à modulação epigenética, tendo sido comprovado como inibidor de desacetilases de histonas (HDACi) e como agente modulador do nível de metilação do DNA e de histonas. Uma vez constatado que o VPA poderia afetar a proliferação celular e os mecanismos de morte celular em alguns tipos celulares, seu potencial como agente antitumoral passou a ser investigado. Em células de glioblastoma, tumor cerebral agressivo, ocorre aumento nos níveis de metilação em diversos promotores de seus genes. No presente trabalho buscamos investigar se em células obtidas de glioblastoma humano os efeitos epigenéticos induzidos pelo VPA ao lado de afetarem a inibição de HDAC, a acetilação da histona H3 (H3ac) e a demetilação global do DNA, afetariam a estrutura da cromatina por estarem associados à acetilação de histonas ou à demetilação do DNA ou a ambas. Células U-251MG sincronizadas na fase G1 do ciclo celular com 10 µM de lovastatina foram cultivadas na presença de VPA 1 mM e 10 mM por 4 e 24 h, e de 5-aza-CdR 5 µM por 28 h (controle de demetilação de DNA). Para o estudo das características estruturais da cromatina nessas condições experimentais, as células foram submetidas à reação de Feulgen seguindo-se análise de imagem por sistema vídeo em microscópio Axiophot 2 equipado com câmera AxioCam HRc e software Kontron KS-400-3. Foram também avaliadas a atividade de HDAC com kit específico, o nível de H3ac por Western Blotting e de 5-metilcitosina (5mC) no DNA por ELISA e imunofluorescência. Detectou-se diminuição na atividade de HDAC e aumento nos níveis de H3ac com o tratamento pelo VPA, porém não com 5-aza-2’-desoxicitidina (5-aza-CdR). Os níveis globais de 5mC diminuíram com os tratamentos por VPA e 5-aza-CdR. A análise de imagem revelou diminuída variabilidade no grau de empacotamento da cromatina e decréscimo na entropia nuclear, definida como o número de bits necessários para o armazenamento dos valores de absorbância por imagem nuclear, nas células U-251MG tratadas por 24 h com VPA (especialmente na concentração mais elevada), porém não nas células tratadas com 5-aza-CdR. Com base nos presentes achados sugere-se que a descompactação da cromatina nas células U-251MG por ação do VPA, o que favoreceria a sua expressão gênica, estaria mais envolvida com a acetilação de histonas do que propriamente com a demetilação do DNA Ver menos

Abstract: Valproic acid is a short-chain fatty acid that, associated with its sodium salt (VPA), has been used in the treatment of several types of neurological diseases. Its performance extends to epigenetic modulation, having been proven as a histone deacetylases inhibitor (HDACi) and as a modulating agent of the level of DNA and histone methylation. Once it was established that VPA could affect cell proliferation and cell death mechanisms in some cell types, its potential as an antitumor agent began to be investigated. In glioblastoma cells, an aggressive brain tumor, there is an increase in methylation levels in several gene promoters. In the present work, we sought to investigate whether in cells obtained from human glioblastoma, the epigenetic effects induced by VPA in addition to affecting HDAC inhibition, acetylation of histone H3 (H3ac) and global DNA demethylation, would affect the chromatin structure because they are associated with histone acetylation or DNA demethylation or even both. U-251MG cells synchronized in the G1 phase of the cell cycle with 10 µM of lovastatin were treated in the presence of 1 mM and 10 mM VPA for 4 and 24 h, and 5 µM 5-aza-CdR for 28 h (a drug used as a DNA demethylation control). In order to study the structural characteristics of chromatin under these experimental conditions, the cells were subjected to the Feulgen reaction followed by image analysis with a video system using an Axiophot 2 microscope equipped with an AxioCam HRc camera and Kontron KS-400-3 software. The activity of HDAC with a specific kit, the level of H3ac by Western Blotting and 5-methylcytosine (5mC) in DNA by ELISA and immunofluorescence were also evaluated. A decrease in HDAC activity and an increase in H3ac levels were detected with VPA treatment, but not with 5-aza-2’-desoxicitidine (5-aza-CdR). Overall, 5mC levels decreased with VPA and 5-aza-CdR treatments. Image analysis revealed decreased variability in the degree of chromatin packing and a decrease in nuclear entropy, defined as the number of bits needed to store absorbance values per nuclear image, in U-251MG cells treated for 24 h with VPA (especially at the highest concentration), but not in cells treated with 5-aza-CdR. Based on the present findings, it is suggested that chromatin decondensation in U-251MG cells by the action of VPA, which would favor their gene expression, would be more involved with histone acetylation than with DNA demethylation Ver menos