Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Xanthomonas citri subsp. citri [recurso eletrônico] : identificação de proteínas secretadas, mecanismos de recrutamento e regulação
Lucas de Moraes Ceseti
TESE
Português
T/UNICAMP C337e
[Functional studies of the Xanthomonas citri subsp. citri type VI secretion system]
Campinas, SP : [s.n.], 2023.
1 recurso online (175 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Sistemas de Secreção do tipo VI (T6SS) são maquinarias celulares empregadas por bactérias para translocar efetores diretamente para células procarióticas ou eucarióticas, intercedendo em conflitos biológicos ou promovendo virulência. O fitopatógeno Xanthomonas citri subsp. citri utiliza seu...
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Resumo: Sistemas de Secreção do tipo VI (T6SS) são maquinarias celulares empregadas por bactérias para translocar efetores diretamente para células procarióticas ou eucarióticas, intercedendo em conflitos biológicos ou promovendo virulência. O fitopatógeno Xanthomonas citri subsp. citri utiliza seu T6SS para resistir a predação por Dictyostelium discoideum, uma ameba de solo que se alimenta de bactérias no ambiente. Entretanto, o papel desempenhado pelo T6SS e os efetores que medeiam este mecanismo de sobrevivência ainda precisam ser esclarecidos. O objetivo deste trabalho foi identificar condições que promovem a expressão e ativação do T6SS e identificar proteínas efetoras secretadas. Os resultados obtidos demonstraram um aumento na transcrição dos genes do T6SS após 9 h de co-incubação com D. discoideum e durante o cultivo da bactéria na superfície de folhas da planta-hospedeira Citrus sinensis. Para identificar proteínas secretadas via T6SS, a expressão e secreção do componente majoritário do tubo do T6SS, Hcp, foi monitorada em amostras de proteínas celulares e de sobrenadante de culturas. A superexpressão do regulador transcricional do T6SS, TagK, foi a única condição encontrada que promoveu aumento detectável nos níveis intracelulares de Hcp. Desta forma, a atividade do T6SS foi analisada em linhagens mutantes nos reguladores pós-transcricionais da atividade do T6SS, PppA e TagF, contendo vetor para a superexpressão de TagK. A secreção de Hcp não foi detectada nos sobrenadantes de culturas destas linhagens, sugerindo a ocorrência de outros níveis de regulação da atividade do T6SS. Diante da dificuldade em detectar atividade do T6SS, outras estratégias para identificação de efetores do sistema foram utilizadas. Assim, foi realizada a caracterização de genes corregulados com o T6SS e que codificam proteínas contendo domínios que sugerem possível função efetora. Para avaliar seus potenciais efeitos citotóxicos, os genes candidatos foram expressos ectopicamente em Saccharomyces cerevisiae e D. discoideum. A expressão de Xac4139 inibiu o crescimento da levedura e causou morte das amebas, enquanto Xac4125 e Xac4123 não exerceram efeito negativo sobre o crescimento de S. cerevisiae. Curiosamente, Xac4125 apresentou uma clara associação com os núcleos da ameba. Através de ensaios de co-purificação, foi demonstrado que Xac4125 e Xac4123 interagem entre si e, isoladamente, com o componente estrutural do T6SS, VgrG. Foi verificado também que estes dois candidatos são essenciais para garantir o fenótipo de resistência de X. citri à ameba. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para uma compreensão mais profunda do papel do T6SS na biologia deste importante fitopatógeno
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Abstract: Type VI Secretion Systems (T6SS) are cellular machineries used by bacteria to translocate effectors directly into eukaryotic or prokaryotic cells, mediating biological conflicts or promoting virulence. The plant pathogen Xanthomonas citri subsp. citri uses its T6SS to resist against...
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Abstract: Type VI Secretion Systems (T6SS) are cellular machineries used by bacteria to translocate effectors directly into eukaryotic or prokaryotic cells, mediating biological conflicts or promoting virulence. The plant pathogen Xanthomonas citri subsp. citri uses its T6SS to resist against predation by Dictyostelium discoideum, a soil amoeba that feeds on bacteria in the environment. However, the role played by the T6SS, as well as the effectors that mediate this survival mechanism remain elusive. The aim of this study was to find conditions that promote T6SS expression and activation and to identify secreted effector proteins. The results showed an increase in T6SS gene transcription after 9 hours of co-incubation with D. discoideum and during bacterial growth on the surface of leaves of the host plant Citrus sinensis. To identify proteins secreted via T6SS, the expression and secretion of the major component of the T6SS tube, Hcp, was monitored in bacterial lysates and culture supernatant samples. Overexpression of the T6SS transcriptional regulator TagK was the only condition found to promote a detectable increase in intracellular Hcp levels. T6SS activity was analyzed in strains deleted on the T6SS post-transcriptional regulators PppA and TagF carrying a vector for TagK overexpression. Hcp secretion was not detectable in culture supernatants of these strains, suggesting the occurrence of other levels of T6SS activity regulation. Therefore, other strategies for identifying T6SS effectors were used. Genes co-regulated with the T6SS and encoding proteins containing domains suggestive of a possible effector function were characterized. To evaluate their potential cytotoxic activities, candidate genes were ectopically expressed in Saccharomyces cerevisiae and D. discoideum. The expression of Xac4139 inhibited yeast growth and caused amoeba death, while Xac4125 and Xac4123 had no negative effect on S. cerevisiae growth. Interestingly, Xac4125 showed a clear association with amoeba nuclei. Co-purification assays showed that Xac4125 and Xac4123 interact with each other and, separately, with the T6SS structural component VgrG. It was also found that these two candidates are essential for the X. citri's amoeba resistance phenotype. Altogether, results of this study contribute to a deeper understanding of the role of T6SS in the biology of this important plant pathogen
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Alvarez-Martinez, Cristina Elisa, 1976-
Orientador
Coelho, Adriano Cappellazzo, 1978-
Avaliador
Miguel, Danilo Ciccone, 1984-
Avaliador
Andrade, Maxuel de Oliveira
Avaliador
Silva Neto, José Freire da
Avaliador
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Lucas de Moraes Ceseti
Estudos funcionais do sistema de secreção do tipo VI de Xanthomonas citri subsp. citri [recurso eletrônico] : identificação de proteínas secretadas, mecanismos de recrutamento e regulação
Lucas de Moraes Ceseti