Strategies for increasing the production of lipids and carotenoids in Rhodotorula toruloides from xylose [recurso eletrônico] = Estratégias para aumentar a produção de lipídeos e carotenoides na Rhodotorula toruloides a partir da xilose
Marina Julio Pinheiro
TESE
Inglês
T/UNICAMP P655s
[Estratégias para aumentar a produção de lipídeos e carotenoides na Rhodotorula toruloides a partir da xilose]
Campinas, SP : [s.n.], 2021.
1 recurso online (103 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Everson Alves Miranda
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química
Resumo: O uso de fábricas celulares para converter açúcares de biomassa lignocelulósica em produtos químicos, tais como oleoquímicos e aditivos alimentares, é essencial para o desenvolvimento de processos sustentáveis. Rhodotorula toruloides é uma levedura que metaboliza naturalmente uma ampla gama...
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Resumo: O uso de fábricas celulares para converter açúcares de biomassa lignocelulósica em produtos químicos, tais como oleoquímicos e aditivos alimentares, é essencial para o desenvolvimento de processos sustentáveis. Rhodotorula toruloides é uma levedura que metaboliza naturalmente uma ampla gama de substratos, incluindo hidrolisados lignocelulósicos, e os converte em lipídeos e carotenoides. Neste estudo, o estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio (H2O2) ou irradiação de luz e a evolução adaptativa em laboratório (ALE) foram aplicados para aumentar os níveis de produção de lipídeos e carotenoides na R. toruloides, e também com o objetivo de entender a regulação metabólica da formação destes compostos. Para tanto, realizou-se caracterização fisiológica detalhada em cultivos em batelada, utilizando xilose como único substrato, combinando-se com análises de proteômica absoluta e modelos metabólicos em escala genômica. Nos cultivos da R. toruloides em biorreator, a irradiação de luz branca resultou em aumento de 70% e 40% na produção de carotenoides e lipídeos, respectivamente, em comparação com a condição de referência (sem adição de estresse oxidativo). A presença de H2O2 aumentou a produção de lipídeos em 95%, atingindo um conteúdo lipídico de 65%; entretanto, não afetou a produção de carotenoides. Já a cepa obtida através da ALE, elevou a produção de carotenoides em 2 vezes, para 44 mg/L. Ao longo do crescimento da R. toruloides, foi possível identificar três fases distintas durante o consumo da xilose baseando-se nas medições online de crescimento e excreção de CO2. Os dados de proteômica demonstraram que na fase de limitação de nitrogênio teve-se maior atividade do mecanismo de regeneração do cofator NADPH, da fosfoketolase e uma redução na atividade da beta-oxidação, correlacionando-se com o aumento do rendimento de lipídeos. A cepa adaptada demonstrou um aumento na alocação de proteínas relacionadas à mitocôndria e ao metabolismo de aminoácidos, potencial explicação para um metabolismo mais eficiente. Este trabalho apresenta uma visão holística da conversão de xilose em óleo microbiano e carotenoides por R. toruloides, visando a aplicação desta levedura em biorefinarias. A partir dos dados de proteômica identificou a baixa expressão das enzimas relacionadas à via de síntese dos carotenoides como um possível gargalo da produção destes compostos. Dessa forma, objetivou-se a superexpresssão dos genes da via dos carotenoides nesta levedura, o que resultou em cepa com produção de carotenoides duas vezes maior que a cepa parental. Para tanto, uma plataforma padronizada para a construção de cassete de expressão para R. toruloides foi desenvolvida baseada no método de Golden Gate Assembly, visando tornar mais eficiente o processo de engenharia metabólica para essa levedura
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Abstract: The use of cell factories to convert sugars from lignocellulosic biomass into chemicals in which oleochemicals and food additives, such as carotenoids, is essential for the shift towards sustainable processes. Rhodotorula toruloides is a yeast that naturally metabolises a wide range of...
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Abstract: The use of cell factories to convert sugars from lignocellulosic biomass into chemicals in which oleochemicals and food additives, such as carotenoids, is essential for the shift towards sustainable processes. Rhodotorula toruloides is a yeast that naturally metabolises a wide range of substrates, including lignocellulosic hydrolysates, and converts them into lipids and carotenoids. In this study, the oxidative stress induced by hydrogen peroxide or light irradiation, and adaptive laboratory evolution (ALE) were applied to improve the production levels of lipids and carotenoids in R. toruloides, and also, to understand the metabolic regulation of formation of these compounds. For that, a detailed physiology characterisation was carried out in batch cultivation, using xylose as sole carbon source, in combination with absolute proteomics and genome-scale metabolic models. In R. toruloides cultivation, the use of white light irradiation resulted in 70% higher carotenoid and 40% higher lipid content compared to reference condition. The presence of hydrogen peroxide did not affect carotenoid production but culminated in the highest lipid content of 0.65 g/gDCW. The adapted strain showed improved fitness and 2.3-fold higher carotenoid content than the parental strain. During the xylose consumption in batch cultivation, three distinct growth phases were identified based on the online measurements of growth and CO2 excretion. In the nitrogen limitation phase, the proteomic data demonstrated an improved NADPH regeneration, phosphoketolase activity and reduced beta-oxidation, correlating with increasing lipid yields. The adapted strain showed an increased allocation of proteins related to mitochondria and amino acid metabolism, potentially explaining the more efficient metabolism. From the system biology data, it was possible to identify the low expression of enzymes related to carotenoid synthesis, which can mean a bottleneck in the production of these compounds in R. toruloides. Therefore, the overexpression of the carotenogenic genes was carried out in this work, and our best-engineered strain produced twice more carotenoids than the parental strain. For the construction of expression cassettes for R. toruloides, a standardized platform was developed based on the Golden Gate Assembly method. This work presented a holistic view of xylose conversion into microbial oil and carotenoids by R. toruloides, in a process towards renewable and cost-effective production of these molecules and aiming to make the process of metabolic engineering for this yeast more efficient
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Miranda, Everson Alves, 1959-
Orientador
Gombert, Andreas Karoly, 1970-
Avaliador
Azzoni, Adriano Rodrigues, 1971-
Avaliador
Giordano, Roberto de Campos
Avaliador
Beppu, Marisa Masumi, 1972-
Avaliador
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Marina Julio Pinheiro
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Marina Julio Pinheiro