Resumo: As enzimas possuem uma vasta área de aplicação industrial, sendo desejável potencializar sua estabilidade nas condições de processo. Umas das formas mais vantajosas de alcançar esse objetivo é por meio da imobilização, técnica que torna a estrutura da enzima mais rígida e insolúvel, o que também possibilita sua reciclagem e, consequentemente, reduz os custos do processo. A formação de ligação covalente entre a enzima e um suporte inerte, insolúvel e, preferencialmente, de baixo custo, como a quitosana, é um exemplo de imobilização aplicável. Comercialmente e em termos de pesquisa, as enzimas proteolíticas ainda são pouco exploradas em técnicas de imobilização, em comparação a outros grupos de enzimas, como as lipases. As proteases são largamente aplicadas na hidrólise de proteínas, todavia, a grande maioria dos estudos centra-se na utilização das enzimas em sua forma livre. Assim, estudar a imobilização de proteases associada à aplicação na produção de hidrolisados proteicos torna-se um processo inovador e com vantagens competitivas em relação aos processos tradicionais. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar a imobilização de uma protease alcalina de "Bacillus licheniformis" (Protezyn APP 3000) por ligação covalente em quitosana modificada por glutaraldeído e etilenodiamina e aplicar as enzimas imobilizadas na hidrólise de proteínas. As melhores condições de imobilização observadas foram: suporte de quitosana a 5% (m/v) modificada apenas com glutaraldeído a 5% (v/v) diluído em água, solução de imobilização com a enzima diluída em água, proporção enzima:suporte (m/m) de 1:100 e tempo de imobilização de 2 h. Nessas condições, a enzima apresentou carregamento de 69,9%, eficiência de 33,6%, efetividade de 48,3% e fatores de estabilidade de 2,4 a 60 °C e 2,47 a 50 °C em relação à enzima livre. A caracterização bioquímica por meio de um DCCR mostrou que o pH e a temperatura para máxima atividade catalítica da enzima imobilizada manteve as mesmas condições da enzima livre (pH 9 e 60 °C), porém, a imobilização resultou em uma enzima com uma faixa de atuação mais ampla. Ao ser reutilizada, a enzima imobilizada reteve 47,08% da atividade inicial após três ciclos. A enzima imobilizada foi promissora ao hidrolisar a caseína, hemoglobina e proteína de soja apresentando valores de absorbância relativa à da enzima livre de 78%, 75% e 82%, respectivamente, e, além disso, foi mais eficiente sobre a gelatina do que a enzima livre. Diante disso, o processo de imobilização conduzido se mostrou promissor ao estabilizar uma enzima comercial que está sendo estudada pela primeira vez e pode ser otimizado a fim de melhorar o carregamento, a eficiência, a efetividade, a estabilidade e a reusabilidade da enzima Ver menos

Abstract: Enzymes have a wide area of industrial application, and it is desirable to enhance their stability under process conditions. One of the most advantageous ways to achieve this goal is through immobilization, a technique that makes the enzyme structure insoluble and less flexible, which also enables its recycling and, consequently, reduces the costs of the process. The formation of a covalent bond between the enzyme and an inert, insoluble and, preferably, low-cost support, such as chitosan, is an example of applicable immobilization. Commercially and in terms of research, proteolytic enzymes are still few explored in immobilization techniques, compared to other enzymes groups, such as lipases. Proteases are widely applied in protein hydrolysis; however, the vast majority of studies are focused on the use of enzymes in their free form. Thus, studying the proteases immobilization associated with their application in protein hydrolysates production becomes an innovative process with competitive advantages in relation to traditional processes. At this context, the objective of this work was to study the immobilization of an alkaline protease from "Bacillus licheniformis" (Protezyn APP 3000) by covalent bonding in chitosan modified by glutaraldehyde and ethylenediamine and to apply it as immobilized enzymes in protein hydrolysis. The best conditions of immobilization observed were: 5% chitosan support (m/v) modified only with 5% glutaraldehyde diluted in water (v/v), immobilization solution with the enzyme diluted in water, enzyme:support ratio (m/m) of 1:100 and immobilization time of 2 h. Under these conditions, the amount of immobilized enzyme was 69.9%, the efficiency was 33.6%, effectiveness was 48.3% and stability was 2.4 at 60 °C and 2.47 at 50 °C in relation to the free enzyme. Biochemical characterization using a CCRD revealed that the pH and temperature for maximum catalytic activity of immobilized enzyme maintained the conditions of the free enzyme (pH 9 and 60 °C), but the immobilization resulted in enzymes with a wider range of action. When reused, the immobilized enzyme retained 47.08% of its initial activity after three cycles. The immobilized enzyme was promising in hydrolyzing casein, hemoglobin and soy protein with absorbance values relative to the free enzyme of 78%, 75% and 82%, respectively, and, in addition, it was more efficient on gelatin than the free enzyme. Therefore, the immobilization process carried out has shown to be promising in stabilizing a commercial enzyme, which is being studied for the first time, and can be optimized in order to improve the loading, efficiency, effectiveness, stability and reusability of the enzyme Ver menos