Padronização do metodo imunoenzimatico celular-CELISA-para detecção de aloanticorpos leucocitarios
Sandra Trevisan Beck
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP B388p
Campinas, SP : [s.n.], 1998.
88f. : il.
Orientador: Sofia Rocha Lieber
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Convencionalmente, a sensibilização aos antígenos HLA é definida pelo nível de reatividade do soro do paciente contra painel de linfócitos de pelo menos 30 indivíduos HLA distintos, empregando-se o método de citotoxicidade dependente de complemento (COC). A necessidade de obtenção de...
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Resumo: Convencionalmente, a sensibilização aos antígenos HLA é definida pelo nível de reatividade do soro do paciente contra painel de linfócitos de pelo menos 30 indivíduos HLA distintos, empregando-se o método de citotoxicidade dependente de complemento (COC). A necessidade de obtenção de linfócitos viáveis torna o método difícil de ser processado num curto espaço de tempo. O presente trabalho teve por objetivos: a padronização do método CELlSA, passível de automação, utilizando-se suspensões desidratadas de linfócitos T, armazenadas em microplacas a -20°C; e a avaliação de sua sensibilidade e especificidade em relação ao método de COC e potencializado com antigamaglobulina humana (COC-AGH). Partindo de soros controles HLA-positivos e HLA-negativos, foram avaliados os seguintes pontos: tipo de placas poliestireno disponíveis no mercado; tampões bloqueadores de sítios inespecíficos; concentração do conjugado e métodos de tratamento do soro, descritos a seguir. Com o uso de solução bloqueadora constituída de tampão TRIS/HCL (pH 7,6), 0,1% de Triton-X-100, 1% de soro de coelho e 3% de leite em pó desnatado, os três tipos de placas avaliadas mostraram resultados semelhantes. Recomenda-se portanto, o uso de SX104 linfócitos por escavação (SOµ I de 1X106/PBS), devido ao fato de que concentrações maiores resultaram em aumento de reações inespecíficas e concentrações menores diminuíram a sensibilidade do teste. Antes da realização dos testes, as amostras de soro devem ser previamente congeladas, posteriormente tratadas com trombina e centrifugadas, pois soros de alguns pacientes com desordem de coagulação, apresentam restos de fibrina, mesmo após a retração do coágulo, levando a resultados falsos-positivos. A comparação de 226 provas cruzadas revelou 75,2 % de concordância entre os métodos CELlSA e COC e 81,4% entre os métodos CELlSA e COC-AGH, utilizando-se soros de gestantes no primeiro trimestre de gestação e pacientes renais crônicos politransfundidos. Em relação à boa ou à má evolução do enxerto renal, não foi possível avaliar a relevância de aloanticorpos detectados pelos métodos CELlSA ou COC-AGH, devido ao pequeno número de pacientes transplantados, incluídos no estudo. Finalmente conclui-se que o método de CELlSA se mostrou útil para a pesquisa de anticorpos anti-linfocitários, com sensibilidade compatível com o método COC potencializado por AGH. Entretanto, anticorpos da classe IgM ou de baixa avidade não seriam detectados pelo método CELlSA. Este fato, porém, não invalida o objetivo proposto, de determinação do nível de RCP na amostra pré-transplante. O método também pode ser empregado, rotineiramente, para acompanhar a evolução da RCP em amostras de soro de pacientes renais crônicos, colhidas ao longo do tempo. Quando não for possível a caracterização das especificidades, recomenda-se a realização da RCP pelo método COC-AGH, que, embora mais trabalhoso e dependente de células viáveis, é, como o CELlSA, nitidamente mais sensível que o método COC clássico
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Abstract: Conventionally, HLA allosensitization is defined by the reactivity levei of the patient's serum against a panel of Iymphocytes of at least 30 distinct HLA individuais (RCP), by the classic complement Iymphocytotoxicity assay (COC). This method is difficult to process in a short period of...
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Abstract: Conventionally, HLA allosensitization is defined by the reactivity levei of the patient's serum against a panel of Iymphocytes of at least 30 distinct HLA individuais (RCP), by the classic complement Iymphocytotoxicity assay (COC). This method is difficult to process in a short period of time due to the need of obtainig viable Iymphocytes. The aim of the presente work was to standardize the CELlSA method, with possible automation, using dehydrated suspensions of T Iymphocytes, stored on microplates at -200 and to evaluate their sensitivity and specificity for COC and potencialized with human antiglobulin (COC-AHG). Based on HLA positive and HLA negative control sera, the following topics were evaluated: types of microtiter plates available on market, blocking buffers for undetermined sites, conjugate concentration and serum treatment methods. When a blocking solution composed of TRIS-HCL(pH 7,6), 0,1% Triton-x-100, 1% rabbit serum and 3% non fat milk powder, was used the tree types of plates which were evaluated presented similar results. We recommend the use of 5x104 Iymphocytes per well (SOµ of 1x1061PBS), as higher concentration resulted in an increase in non specific reactions and lower concentration a decrease the sensibility of the test. Sefore the tests are carried out, the serum samples should be frozen, and afterwards treated with thrombin and centrifuged, due to the fact that serum of some patients with coagulation disorders may present fibrin clots even after clot retraction, and this could lead to false positive results. The comparison of 226 crosmatches tests revealed that there was a concordance of 75,2% between CELlSA and COC methods and a of 81,4% between CELlSA and COC-AHG methods, using the serum of pegnant women in the first trimester and of poli-transfused chronic renal patients. It was not possible to evaluate the relevance of the all oantibodies detected by CELlSA and COG.AGH methods in graft outcome due to the small number of transplanted patients included in this stud. Finally we conclude that the CELlSA method was useful in the detection of Iymphocyte alloantibodies, presenting an equivalent sensitivity to the potencilized COC method (AHG protocol). However IgM class antibody or low affinity antibodies would not be detected by the CELlSA method, this fact though, does not invalidate the purpose of this work, which was the determination of the RCP level in pre-transplantation samples. The method can be used, routinely, to follow-up the evolution of RCP in the serum samples of chronic renal patients, collected at different times. When the identification of HLA specificities is not possible, we recommend to perform RCP using the COG.AHG method, which in spite of being laborious and dependent on viable cells, is, as CELlSA , clearly more sensitive than the classic COC method
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Padronização do metodo imunoenzimatico celular-CELISA-para detecção de aloanticorpos leucocitarios
Sandra Trevisan Beck
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Sandra Trevisan Beck
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